發酵牛肉調味基料對三株致病菌的抑菌作用及機理

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(1.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384; 2.天津農學院水產學院,天津 300384)

病原微生物污染是引起食源性疾病的主要原因之一,嚴重威脅著人類健康和社會經濟發展[1]。抑制食品中腐敗微生物生長繁殖,提高食品安全的研究水平尤為重要[2-3]。隨著科技的發展和現代食品安全質量標準的提高,綠色、安全、高效的抑菌劑開發成為學者研究的重點[4]。研究發現,小分子肽經美拉德反應后,不僅可以提升產物氣味和滋味[5],其終產物的抑菌作用也有所增強[6-7]。

陳金斌等[8]研究發現蟹肉酶解多肽與木糖等美拉德反應產物對金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌等四種常見食品污染菌均有不同程度的抑制作用。李婷等[9]研究發現,100 ℃加熱60 min,黃鯽蛋白抗菌肽-葡萄糖美拉德反應物對大腸桿菌的抑菌圈直徑可達28.9 mm。董志儉等[10]以低值蝦酶解液為原料,通過美拉德反應制備蝦味香精,發現其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較好的抑菌性。研究表明,美拉德反應的抑菌性可能與產物中的類黑精[11]、氨基還原酮、吲哚[12]等衍生物及其氧化還原電位有關[13]。發酵牛肉調味料(Fermented Beef Flavorings,FBF)是以牛骨肉末為原料,經高壓浸提、酶解、發酵、美拉德反應等環節制成的一種熱反應肉味香精[14]。本實驗室前期確定了FBF的抑菌活性,同時從常用的15株肉品發酵劑中篩選得到WBL-45(木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌)、VHI-41(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌)、清酒乳桿菌(Lactobacillussake,LS)為發酵劑制得的FBF抑菌活性更強[15],但是FBF的抑菌方式并未明確。

試驗以WBL-45、VHI-41、LS為發酵劑制作FBF,選用大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別作為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的典型指示菌,通過測定不同FBF對三株指示菌的半數抑制濃度(Inhibitory Concentration 50,IC50)、FBF處理指示菌后的生長曲線、菌體細胞形態的變化以及FBF對細胞膜通透性的影響,綜合分析FBF的抑菌機理,從而為FBF更好地應用于食品產業提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍牛骨肉末(骨肉比為3∶7) 頂興(天津)食品科技發展有限公司提供;WBL-45、VHI-41 意大利薩科公司；LS 薩科商業復合菌中分離純化獲得;風味蛋白酶(500 LAPU/g)、復合蛋白酶(1.5 AU/g) 丹麥諾維信公司;金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌(CMCC 50094) 中國農業大學微生物實驗室提供;MRS液體培養基 北京索萊寶科技有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy有限公司;THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;Friocell 22恒溫恒濕培養箱 艾力特國際貿易有限公司;Bioscreen C微生物全自動生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司;Phenom Pro臺式掃描電鏡 Phenom word BV公司;2265FS溶液EC計 沃德精準(北京)科貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組設計 實驗共設計了四組,具體分組介紹見表1。

1.2.2 菌種的活化及菌懸液的制備 WBL-45、VHI-41、LS發酵劑于MRS液體培養基37 ℃連續活化3代。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌于LB液體培養基中，37 ℃下活化3代,用無菌LB稀釋至107CFU/mL。

1.2.3 不同FBF的制作

1.2.3.1 工藝流程 原料選擇(牛骨肉末)→高壓浸提→酶解→發酵12 h(或不發酵)→美拉德反應→過濾[15]。

1.2.3.2 操作要點 a.高壓浸提:將63 g牛骨肉末及252 g蒸餾水以1∶4的比例混合,0.1 MPa、121 ℃下加熱4 h。吸取5 mL用于pH的測定。

b.酶解:浸提液冷卻至室溫,分別添加0.186 g風味蛋白酶和0.093 g的復合蛋白酶,于50 ℃振蕩4.5 h,酶解結束后沸水浴滅酶20 min。吸取5 mL用于pH的測定。

c.發酵:將WBL-45、VHI-41、LS分別接種,30 ℃發酵12 h,接種量保證在106CFU/mL,發酵結束后沸水浴滅菌20 min。吸取5 mL用于pH的測定。CK組跳過此步驟。

d.美拉德反應:添加3.6 g木糖、3.6 g葡萄糖、2.7 g半胱氨酸、1.35 g甘氨酸、1.35 g丙氨酸、5.4 g VB1,攪拌均勻后在110 ℃下美拉德反應60 min。吸取5 mL用于pH的測定。

e.過濾:將美拉德反應液于4 ℃靜置12 h,雙層紗布過濾去除骨渣和脂肪,過0.45 μm水膜。FBF于4 ℃貯藏備用。

1.2.4 三種FBF分別對三株指示菌IC50的確定 參考林洋等[16]方法并作適當修改。試驗通過光密度法確定FBF對指示菌抑制率的影響。設置7個系列濃度梯度FBF,通過觀察指示菌菌液在含不同濃度FBF培養基中生長狀態的差異,探究FBF濃度與抑菌率關系,以7個濃度梯度中,抑菌率最接近50%(±5%)的稀釋濃度為IC50濃度。具體操作如下:采用二倍稀釋法,用無菌鹽水將三種FBF分別稀釋成7個系列濃度梯度(分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 mL/100 mL),移取上述稀釋液30 μL于96孔板中,與70 μL指示菌懸液進行混合。每種FBF終濃度分別為30、15、10、7.5、3.75、1.88、0.93 mL/100 mL。37 ℃反應12 h,測定600 nm下的OD指示菌+FBF值。同時做空白對照和陽性對照,分別測定600 nm下的ODLB+鹽水、OD指示菌+鹽水、ODLB+FBF。試驗以OD對照表征指示菌正常生長狀態,OD實際值表征指示菌在含有FBF培養基中生長情況,通過計算觀察FBF對指示菌生長狀態的影響,由此確定三種FBF對三株指示菌IC50。計算公式如下所示。

表2 FBF處理3株指示菌的終濃度(mL/100 mL)Table 2 Final concentration of three indicator strains treated with FBF(mL/100 mL)

OD實際值=OD指示菌+FBF-ODLB+FBF

OD對照=OD指示菌+鹽水-ODLB+鹽水

式中,ODLB+鹽水為70 μL LB+30 μL鹽水600 nm下的OD值;ODLB+FBF為70 μL LB+30 μL FBF600 nm下的OD值;OD指示菌+鹽水為70 μL指示菌+30 μL鹽水600 nm下的OD值。

1.2.5 不同FBF濃度下三個指示菌的生長曲線 參考Shi等[17]方法并作適當修改。通過1.2.4試驗結果,確定了三組FBF針對三株指示菌各自的IC50濃度。由于同一FBF針對不同指示菌IC50濃度存在差異,同一指示菌不同FBF的IC50濃度也不同。為方便操作和表述,三組FBF均選用兩個濃度進行此部分試驗。濃度1的FBF為針對三株指示菌IC50濃度所對應的不同稀釋倍數,濃度2的FBF為原液。將兩種濃度的FBF 60 μL置于酶標板中,分別與140 μL指示菌菌液混合,使得酶標板中各組FBF終濃度分別為針對不同指示菌的IC50濃度和30 mL/100 mL。具體處理的終濃度如表2所示。將樣品置于微生物全自動生長曲線分析儀中,于37 ℃條件下每隔15 min測定各孔樣品在波長600 nm下的OD值,繪制指示菌經FBF處理后的生長曲線。試驗設置60 μL鹽水+140 μL指示菌為對照組,同時測定CK組原液對指示菌生長狀態的影響。

1.2.6 不同FBF對指示菌細胞形態的影響 為了更加直觀有效地觀察FBF對指示菌菌體形態的影響,試驗以LS組為代表,采用高濃度FBF處理指示菌。參考石超[18]方法并作適當修改。將大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃,130 r/min活化12 h。三株指示菌均在4 ℃,2000×g下離心15 min,收集菌體,用無菌生理鹽水沖洗3次后重懸于鹽水中,使OD600 nm約為0.5。取700 μL指示菌重懸液,加入300 μL FBF混合,以700 μL指示菌液+300 μL鹽水為對照,37 ℃反應12 h,離心(4 ℃、6000×g、10 min),2%多聚甲醛溶液(Paraformaldehyde,PFA)+2.5%戊二醛固定,4 ℃過夜。0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗樣品3次,每次10 min。使用呈梯度濃度的酒精(50%、70%、80%、90%、100%)洗脫,叔丁醇置換酒精,冷凍干燥,噴金后上掃描電鏡觀察細胞結構。

1.2.7 不同FBF對指示菌膜通透性的影響 本實驗通過測定指示菌液的相對電導率研究不同FBF濃度對膜通透性的影響。參考張赟彬等[19]、Diao等[20]的方法并作適當修改。用滅菌的5%葡萄糖溶液將WBL-45、VHI-41、LS組FBF稀釋至不同指示菌的IC50濃度。三株指示菌分別接種于 LB 液體培養基,37 ℃振蕩培養12 h,離心(4000×g,4 ℃,10 min),5%葡萄糖溶液沖洗菌體三次,重懸于5%葡萄糖溶液中,使OD600 nm約為0.5,此為等滲菌液。取等滲菌液3.5 mL,加入IC50濃度的FBF 1.5 mL,37 ℃下培養12 h。測定0和12 h的電導率,分別記為EC1和EC2，通過公式計算，了解IC50濃度下FBF處理指示菌菌液后的相對電導率(相對電導率(IC50-FBF),%)。試驗采用沸水加熱5 min的指示菌菌液的相對電導率為對照[相對電導率(0FBF)(%)，即不使用FBF處理指示菌，通過沸水加熱5 min，對指示菌進行處理，觀察菌液相對電導率的變化]。具體操作如下:取3.5 mL等滲菌液與1.5 mL葡萄糖溶液混合,37 ℃培養12 h后沸水浴 5 min,測定沸水浴前后的相對電導率,分別記為EC3和EC4。菌種膜通透性的相對電導率根據如下公式計算。

式中,EC1為FBF與指示菌菌液剛混合時的電導率;EC2為FBF與指示菌菌液混合12 h后的相對電導率;EC3為沸水浴前無菌生理鹽水與指示菌菌液的電導率;EC4為沸水浴后無菌生理鹽水與指示菌菌液的電導率。

1.3 數據分析

使用Excel 2016處理數據,用Sigma plot 10.0繪圖,用Statistix 8.1中Tukey HSD進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 確定FBF對指示菌的IC50

光密度法是檢測微生物生長狀態的方法之一,微生物菌體在600 nm有特征吸收峰,OD600 nm越高代表菌體數量越多。本研究測定了指示菌在含不同濃度FBF培養基中生長后的OD600 nm,以反映FBF對指示菌的生長抑制作用。OD600 nm值越低,代表FBF對指示菌生長抑制越強烈,反之則代表抑制效果較弱。

大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌經不同濃度FBF處理后的生長情況分別見圖1A～C?？傮w而言,高濃度的對照組(CK)和三組FBF對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的生長均有顯著的抑制作用(P<0.05);低濃度的牛肉調味料,尤其是CK組對菌體的生長有促進作用。與CK組相比,FBF對菌體的生長抑制作用更強,三組FBF濃度在1.88～30 mL/100 mL范圍內對指示菌的生長抑制作用呈濃度依賴關系。WBL-45、VHI-41、LS組FBF對大腸桿菌的IC50均為3.75 mL/100 mL,而CK組終濃度為30 mL/100 mL時(體系中最高濃度),其對大腸桿菌抑制率僅為22%左右。對乙型副傷寒沙門氏菌而言,WBL-45、VHI-41、LS組IC50為7.5、3.75和3.75 mL/100 mL。四種牛肉調味基料對金黃色葡萄球菌的抑制作用均隨濃度的增加而增強。VHI-41、LS組FBF對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強,IC50均為1.88 mL/100 mL,WBL-45對金黃色葡萄球菌的IC50為3.75 mL/100 mL,CK組為10 mL/100 mL。高壓浸提、酶解、發酵等環節可使牛骨肉末中的大分子營養物質蛋白質等降解為小分子肽或氨基酸,低濃度FBF中小分子物質的存在可促進指示菌生長繁殖,隨著FBF濃度的升高,抑菌物質不斷累積,FBF的抑菌作用增強,FBF抑菌作用與濃度存在依賴關系。

圖1 指示菌IC50的確定Fig.1 Determination of target bacteria IC50 注:A:大腸桿菌IC50的確定;B:乙型副傷寒沙門氏菌 IC50的確定;C:金黃色葡萄球菌IC50的確定。

2.2 指示菌的生長曲線

進一步采用生長曲線法,探討牛肉調味基料對指示菌生長的控制作用。將大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌培養在含有IC50及30 mL/100 mL FBF培養基上,監控培養24 h的生長曲線。結果如圖2～圖4,曲線1、11、21分別為大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌在37 ℃條件下正常的生長曲線,可以明確區分生長的4個時期:延滯期、對數期、穩定期、衰亡期[21]。0～100 min是延滯期,100～800 min為對數生長期,隨后是穩定期。

圖2 大腸桿菌生長曲線Fig.2 Growth curve of Escherichia coli

注:1:對照組大腸桿菌生長曲線;2:WBL-45組濃度2處理的大腸桿菌(WBL-45終濃度為30 mL/100 mL)的生長曲線(WBL45-30 mL/100 mL);3:VHI41-30 mL/100 mL;4:LS-30 mL/100 mL;5:CK-30 mL/100 mL;6:用濃度1的WBL-45處理的大腸桿菌的生長曲線(WBL45-IC50);7:VHI41-IC50;8:LS-IC50。

圖3 乙型副傷寒沙門氏菌生長曲線Fig.3 Growth curve of Salmonella paratyphi B

注:11:對照組乙型副傷寒沙門氏菌的生長曲線;12:WBL-45濃度2處理的乙型副傷寒沙門氏菌(WBL-45終濃度為30 mL/100 mL)的生長曲線(WBL45-30 mL/100 mL);13:VHI41-30 mL/100 mL;14:LS-30 mL/100 mL;15:CK-30 mL/100 mL;16:用濃度1的WBL-45處理的乙型副傷寒沙門氏菌的生長曲線(WBL45-IC50);17:VHI41-IC50;18:LS-IC50。

圖4 金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.4 Growth curve of Staphylococcus aureus

注:21:對照組金黃色葡萄球菌的生長曲線;22:WBL-45濃度2處理的金黃色葡萄球菌(WBL-45終濃度為30 mL/100 mL)的生長曲線(WBL45-30 mL/100 mL);23:VHI41-30 mL/100 mL;24:LS-30 mL/100 mL;25:CK-30 mL/100 mL;26:用濃度1的WBL-45處理的金黃色葡萄球菌的生長曲線(WBL45-IC50);27:VHI41-IC50;28:LS-IC50。

觀察FBF處理對大腸桿菌生長狀況的影響,VHI41-IC50、LS-IC50組與對照組大腸桿菌在100 min左右進入對數生長期,CK-30 mL/100 mL組約在150 min進入對數生長期,進入穩定期時,正常狀態生長的大腸桿菌菌液OD600 nm約為0.6,高于經3組濃度1和濃度2的FBF處理后的大腸桿菌菌液。經CK組和三組FBF處理后,大腸桿菌出現延滯期延長,對數生長期延后,穩定期OD600 nm值降低的現象。說明FBF處理能夠延遲指示菌對數生長期的到來,降低指示菌的最大比生長速率,從而抑制其生長繁殖。這種現象與其他抑菌物質對病原菌的生長抑制效果一致[22]。在含有高濃度(30 mL/100 mL)FBF的情況下,指示菌在培養的24 h內始終未出現明顯增長,OD600 nm接近于平滑直線,說明高濃度的FBF可以完全抑制三株指示菌的生長繁殖,不過本研究檢測時間有限,不確定在延長培養時間后指示菌是否還能進入對數生長期。綜合分析圖2～圖4可知,添加IC50濃度的FBF延長了大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的生長延滯期,另外,FBF明顯降低了指示菌的最大比生長速率以及成熟期的最高菌量。與CK組相比,同等濃度的FBF對菌體的生長抑制作用更強,尤其是對抑制指示菌最大比生長速率抑制作用更明顯。FBF與CK組的差異主要在于發酵處理的差異。發酵處理使得FBF中抑菌物質大量累積,抑制了指示菌的生長繁殖速度,指示菌37 ℃下生成量少,成熟期指示菌OD600 nm小。

2.3 FBF對指示菌細胞形態的影響

FBF對菌體生長的強烈抑制作用,可能源于FBF中各類抑菌物質對菌體代謝的干擾甚至結構的破壞。圖5直觀地展現了經LS組FBF處理的各種指示菌的形態變化。結果表明:正常狀態下大腸桿菌(圖5A)、乙型副傷寒沙門氏菌(圖5C)呈桿狀,金黃色葡萄球菌(圖5E)呈球狀,三株指示菌形態飽滿、外表光滑;而經LS組FBF處理12 h后,細菌表面塌陷,菌體變形,大腸桿菌細胞表面出現較嚴重的皺縮和塌陷,部分細菌表面出現小孔,甚至發生斷裂(圖5B);乙型副傷寒沙門氏菌細胞出現孔洞,菌體扭曲變形(圖5D);金黃色葡萄球菌失去了圓滑的球狀形態,部分菌體表面出現孔洞,胞膜完整性遭到破壞,某些菌體出現溶解現象(圖5F)。FBF中的抑菌物質可能包含發酵劑代謝產生的有機酸、短鏈脂肪酸、抗菌肽以及美拉德反應產物等。因此FBF處理后菌體呈現明顯破壞作用。

圖5 掃描電鏡觀察指示菌的形態(50000×)Fig.5 The morphology of target bacteria observed under scanning electron microscope(50000×)

注:A:正常大腸桿菌形態;B:30% LS處理12 h的大腸桿菌形態;C:正常乙型副傷寒沙門氏菌形態;D:30% LS處理12 h乙型副傷寒沙門氏菌形態;E:正常金黃色葡萄球菌形態;F:30% LS處理12 h的金黃色葡萄球菌形態。

2.4 FBF對指示菌膜通透性的影響

試驗進一步通過相對電導率的變化來考察FBF對指示菌細胞膜通透性的影響。一般情況下,相對電導率越大,說明菌體電解質滲漏量越多,細胞膜受損越嚴重[23]。IC50濃度FBF處理對指示菌液相對電導率的影響如圖6所示。不同FBF組對指示菌液相對電導率的影響存在明顯差異。IC50濃度FBF和沸水殺菌處理后,大腸桿菌的相對電導率均升高。沸水殺菌使大腸桿菌的相對電導率升高了2%,IC50濃度下的WBL-45、VHI-41、LS處理可分別使大腸桿菌的相對電導率升高10%、3%、11%,由此說明:FBF及沸水殺菌處理均可使大腸桿菌細胞膜通透性增大,胞內電解質外泄,從而抑制大腸桿菌生長繁殖。

圖6 FBF處理對指示菌菌液相對電導率的影響Fig.6 Effects of rhe FBF treatment on relative conductivity of target bacteria 注:不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

觀察乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌經IC50濃度FBF處理12 h后相對電導率的變化,兩種指示菌的相對電導率均呈現降低現象,該結果與畢振飛等[24]的研究有相似之處,該試驗研究了植物抗菌液處理金黃色葡萄球菌8 h內相對電導率的變化,試驗結果表明,抗菌液作用于指示菌后其相對電導率值呈先下降、后上升的趨勢。有研究表明,相對電導率和膜電位存在相關性,細胞通透性主要由膜電位決定,小分子電解質(鉀電導和鈉電導)隨著膜電位去極化程度的增大而增大,隨著超極化程度的增大而降低[25],細胞發生去極化,膜電位降低,相對電導率升高[26],細胞發生超極化現象,膜電位升高,相對電導率降低。由此可以推斷,三組FBF對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌膜通透性影響作用不同,FBF處理使大腸桿菌細胞膜受損,胞內電解質大量泄露,瓦解了細胞質膜屏障,最終導致菌體死亡。FBF作用于乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌,使細胞發生超極化現象,胞膜離子穩態遭到破壞,菌體代謝發生異常,繼而對乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌產生抑制作用。

3 結論

本研究結果表明:低濃度WBL-45組、VHI-41組、LS組FBF對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的生長有一定的促進作用,當FBF濃度增高到1.88～3.75 mL/100 mL時,其對指示菌的生長開始出現抑制,且存在著濃度依賴關系。WBL-45組對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的IC50濃度依次為3.75、7.5、3.75 mL/100 mL,VHI-41組和LS組FBF對三株指示菌IC50濃度依次為3.75、3.75、1.88 mL/100 mL。三種FBF能夠抑制三株指示菌的正常生長和增殖,延長指示菌延滯期、延遲對數期、降低最大生長速率,從而抑制指示菌生長;IC50濃度下處理指示菌,可使細胞發生去極化或超極化,影響菌體電解質或小離子物質正常運輸;FBF還可以破壞細胞的正常形態,造成菌體死亡。本研究初步探討了FBF的抑菌機理,其關鍵抑菌物質及作為調味料應用于產品中的實際抑菌性還需更進一步的研究。