食品中多組分甜味劑和防腐劑同時快速測定方法的建立

程水連 何建國 盧桂英 晏許超 付柏婷

(益陽市產商品質量監督檢驗研究院，湖南 益陽 413000)

目前人工合成甜味劑和防腐劑在日常食品中的應用范圍越來越廣泛，使用的劑量也越來越大，而且超劑量、超范圍濫用的現象層出不窮，為了改善口感和延長食品的保質期，提高食品口感的穩定性，甚至以多組分協同的形式添加。但是攝入過多的甜味劑和防腐劑會對人體產生不良影響，對身體造成負擔、對人體的肝臟和神經系統造成嚴重危害，特別是對代謝排毒能力較弱的小孩、老人和孕婦危害更加明顯，長期食用甚至會致癌、致畸、損害腎功能等副作用[1]。目前食品中常用到的防腐劑主要有納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉，人工合成甜味劑主要有甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜。

食品中的甜味劑和防腐劑大多采用高效液相色譜法來測定，但由于這些添加劑各自的物理、化學及光譜性質存在差異，導致不能直接進行檢測，如甜蜜素沒有紫外吸收基團，需對其進行衍生化才能檢測[1]，三氯蔗糖要用示差檢測器[2]，而且甜味劑和防腐劑的檢測方法一般都是單一組分測定，如GB 500.97—2016是針對食品中甜蜜素的測定，GB 22255—2014是針對食品中三氯蔗糖的測定，GB 5009.28—2016是針對食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定，GB/T 5009.140—2003是針對食品中安賽蜜的測定，GB 5009.263—2016是針對食品中阿斯巴甜的測定，GB 5009.247—2016是針對食品中紐甜的測定，GB/T 23377—2009是針對食品中脫氫乙酸的測定，GB/T 21915—2008是針對食品中納他霉素的測定，GB/T 23383—2009是針對食品中雙乙酸鈉的測定，這些無疑給多種甜味劑和防腐劑的同時檢測增加了難度?，F有的國家標準中，不利于對食品中多種甜味劑和防腐劑的大規模篩查，導致檢測工作量非常大，浪費人力物力，因此有必要開發一種適用性廣、可同時快速測定、靈敏度高的高通量檢測方法，以便高效應對甜味劑和防腐劑在食品中的濫用現象。

食品中甜味劑和防腐劑現有的測定方法有離子色譜法[2]、液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、分光光度法[5]等，其中以液相色譜法測定比較常見。近年來，隨著三重四級桿液質聯用儀的使用，液質法測定甜味劑和防腐劑的報道也逐漸增多。如：王麗娟等[6]采用高效液相色譜—串聯質譜法同時測定葡萄酒中甜味劑、防腐劑和色素，該方法能夠滿足葡萄酒甜味劑、防腐劑和色素含量測定的分析要求；宗珊盈等[7]采用超高效液相色譜—串聯質譜法同時測定食品中7種防腐劑和4種甜味劑，該方法為食品添加劑的測定提供了高效、準確的檢測。SN/T 3538—2013中涉及了6種甜味劑的檢測，但未涉及三氯蔗糖的檢測，且樣品處理繁瑣，樣品需經HLB固相萃取小柱凈化。GB 2760—2014中對甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜6種甜味劑和納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉5種防腐劑的使用和限量都作了規定，以上這些添加劑標準一般都采用高效液相色譜法，對多種添加劑成分進行分析時，對相鄰的色譜峰僅靠保留時間來定性不準確，容易出現假陽性。

高效液相色譜—串聯質譜法ESI負離子模式是利用電場產生帶電液滴繼而通過離子蒸發分析離子的電離過程，在ESI負離子模式下采用不同的碰撞電壓對各目標化合物產生的一級質譜進行全掃描，得到的目標化合物的準分子離子作為母離子和最佳的裂解電壓，然后使用碰撞氣使其分子離子進行二級電離而得到各目標化合物的子離子，確定每種待測化合物的監測離子對，一般選離子豐度最高的兩對，一對作為定量離子對，一對作為定性離子對，再采用多反應監測方式(MRM)監測相應的離子對[8]。且ESI負離子模式通過研究化合物碎裂信息，不僅能夠解析化合物的碎裂途徑以便確認其結構和性質，同時也可以優化其質譜分析條件，為化合物及其降解產物的分析檢測提供了強有力的工具[9]。但用高效液相色譜—串聯質譜法ESI負離子模式來同時測定食品中甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜6種甜味劑和納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉5種防腐劑的方法未見報道。因此有必要建立一種快速測定、準確定性食品中甜味劑和防腐劑的方法。

研究擬利用高效液相色譜—串聯質譜同時測定食品中甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜6種甜味劑和納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉5種防腐劑的含量，以期為食品中添加劑的檢測提供快速、準確、有效的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

三重四級桿液質聯用儀：LCMS-8040型，配有電噴霧離子源(ESI)，日本島津公司；

電子分析天平：AEY-210型，湖南長沙湘儀檢測設備有限公司；

電子天平：AUW120D型，日本島津公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-6型，北京市永光明醫療儀器有限公司；

高速分散勻質機：FJ-200型，上海標本模型廠；

均質器：AVS-100型，轉速不低于20 000 r/min，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

離心機：TD5型，轉速不低于4 200 r/min，長沙英泰儀器有限公司；

超聲波清洗機：PS-80型，深圳潔康超聲波清洗機科技有限公司。

1.2 試劑

甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜、納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉標準品：質量分數>90%，德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；

甲醇：色譜純，德國默克公司；

乙酸銨：色譜純，北京邁瑞達科技有限公司；

水相微孔濾膜：0.22 μm，浙江月旭科技有限公司；

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

冰乙酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

濃鹽酸、濃氨水：分析純，株洲石英化玻有限公司；

氨水(1+1)：量取50 mL濃氨水于燒杯中，加入50 mL 超純水；

鹽酸(1+1)溶液：量取50 mL濃鹽酸于燒杯中，加入50 mL超純水；

106 g/L亞鐵氰化鉀溶液：稱取106.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1 L；

220 g/L乙酸鋅溶液：稱取220.0 g乙酸鋅，先加30 mL 冰乙酸溶解，用水稀釋至1 L；

實驗室用水：超純水，湖南中沃水務環?？萍加邢薰?。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

(1) 含酒精類食品：準確稱取酒樣2.000 0 g于50 mL 燒杯中，于60 ℃水浴上加熱30 min，冷卻至室溫后將其全部轉移至100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度并搖勻，經0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進樣瓶后備用。

(2) 非蛋白質類食品：液體樣品充分混勻，半固體樣品用高速分散勻質機勻漿，固體樣品用粉粹機充分粉粹并混合均勻。準確稱取樣品2.000 0 g于80 mL離心管中，加入10 mL甲醇超聲提取20 min，再加水10 mL超聲提取20 min，用氨水(1+1)或鹽酸(1+1)調節pH至6.5，用20 000 r/min均質器勻漿提取5 min，在4 200 r/min 離心5 min，上清液轉移至100 mL容量瓶中。再重復提取2次，合并上清液，用超純水定容至100 mL，經0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進樣瓶后備用。

(3) 蛋白質類食品：液體樣品充分混勻，半固體樣品用高速分散勻質機勻漿，固體樣品用粉粹機充分粉碎并混合均勻。準確稱取樣品2.000 0 g于80 mL離心管中，加入10 mL甲醇超聲提取20 min，再加水10 mL超聲提取20 min，并加2 mL亞鐵氰化鉀溶液和2 mL乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質，再用氨水(1+1)調節pH至6.5，用20 000 r/min 均質器勻漿提取5 min，在4 200 r/min離心5 min，上清液轉移至100 mL容量瓶中。再重復提取兩次，合并上清液，用超純水定容至100 mL，經0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進樣瓶后備用。

1.3.2 樣品測定方法 將處理好的樣液放在自動進樣器的進樣盤上，進樣量為2 μL，數據實時分析采用LCMS8040工作站進行采集。采用Postrun 瀏覽器軟件，外標法定量，得出樣品中甜味劑的濃度。再根據式(1)計算樣品中各甜味劑的含量。

(1)

式中：

w——樣品中各甜味劑和防腐劑的含量，g/kg；

v——樣品液的定容體積，mL；

c——由譜圖中得出各甜味劑和防腐劑的濃度，μg/L；

m——試樣的質量，g。

1.3.3 色譜和質譜條件：

(1) 色譜條件：選擇Shim-pack XR-ODS III柱(75 L×2.0 mm，1.6 μm)；流速0.25 mL/min；柱溫35 ℃；流動相B為甲醇，流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液。梯度洗脫條件：0.00～1.00 min，10% B；1.00～4.00 min，10%～90% B；4.00～9.00 min，90% B；9.00～10.00 min，90%～10% B；10.00～15.00 min，10% B；15.01 min，控制器停止。

(2) 質譜條件：選擇電噴霧離子源(ESI)；采用多反應監測(MRM)負離子掃描；噴霧電壓4.5 kV；脫溶劑管溫度95 ℃；加熱塊溫度450 ℃；霧化氣流量15 L/min；干燥氣流量3 L/min；氬氣作為碰撞氣，碰撞氣壓力0.6～0.7 MPa。

2 結果與分析

2.1 各標準物質提取離子圖譜

將標準物質溶液按1.3.3色譜和質譜條件進樣，得到各組分提取離子圖譜，見圖1。

2.2 樣品前處理方法優化

(1) 酒類樣品：酒類主要含有水和乙醇，由于乙醇的存在，會導致目標化合物從色譜柱上洗脫下來的時間大大縮短，導致了保留時間不穩定，從而使目標化合物的保留時間前移，以至于目標化合物未在所設的時間窗中，出現假陰性的結果。為了消除乙醇對檢測結果的影響，將酒樣于60 ℃水浴上加熱30 min以除去乙醇，再用超純水定容，最后經0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進樣瓶后備用。

(2) 非蛋白類樣品：只要加入甲醇超聲，再加入水超聲，再用氨水(1+1)或鹽酸(1+1)調節pH值為6.5，離心提取并定容，最后經0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進樣瓶后備用。

(3) 蛋白類樣品：由于蛋白質的存在，會吸附一定量的目標化合物，故先加入甲醇超聲，再加入水超聲，用亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液除去蛋白質，用氨水(1+1)調節pH值為6.5，離心提取并定容，再經0.22 μm水相微孔濾膜過濾至進樣瓶后備用。

2.3 色譜條件的選擇

對于三重四級桿液質聯用儀來說，流動相的選擇不僅要考慮色譜系統的洗脫能力，而且還要考慮目標化合物在質譜中的離子化效率。由于試驗研究的6種甜味劑和5種防腐劑，除納他霉素外，都能很好地溶于水，分別采用甲醇—水、乙腈—水為流動相進行比較。試驗表明：雖然乙腈在液相中的洗脫能力比甲醇好，但是進入質譜系統后，6種甜味劑和5種防腐劑的離子化程度明顯受到抑制，離子豐度比明顯降低，導致靈敏度下降，說明了乙腈的離子化效率低，所以流動相的有機相采用甲醇。

為了使6種甜味劑和5種防腐劑的離子化達到最優靈敏度，所以進行了以下試驗：在水相中分別添加5 mmol/L 乙酸銨、10 mmol/L乙酸銨、20 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨，同一濃度的6種甜味劑和5種防腐劑的峰面積數據見表1。結果表明：加入10 mmol/L 乙酸銨時得到最優的靈敏度，所以最終確定流動相為甲醇—10 mmol/L乙酸銨的水溶液，并采用梯度洗脫，6種甜味劑和5種防腐劑在5 min內得到了最佳分離效果，甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉的保留時間見表2。結果表明：從各物質響應值、保留時間及離子化效率等綜合分析，甲醇—10 mmol/L乙酸銨作為流動相時，優于甲醇—其他濃度的乙酸銨溶液，故試驗采用甲醇—10 mmol/L乙酸銨作為流動相。

圖1 6種甜味劑(甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜)和5種防腐劑(納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉)的提取離子色譜圖Figure 1 Extraction ion chromatography ofsix kinds of sweeteners (sodium cyclamate, saccharinsodium, acesulfame K, trichlorosucrose, aspartame and neotame) and five kinds of preservatives (natamycin, sodium benzoate, potassium sorbate, sodium dehydroacetate and sodium diacetate)

表1 流動相組成對各甜味劑和防腐劑組分峰面積的影響Table 1 The composition of mobile phase to influence on the peak area of sweeteners and preservatives

2.4 質譜條件的建立和定性確證

試驗研究的6種甜味劑和5種防腐劑均是極性物質，故采用電噴霧離子源進行離子化。試驗中分別采用了正、負離子模式，發現負離子模式下的離子化效率明顯高于正離子模式。在全掃描模式下，對于甜蜜素、安賽蜜、苯甲酸鈉、雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉來說，確定了M-Na作為母離子；對于糖精鈉來說，確定了M-2H2O-Na作為母離子；對于山梨酸鉀來說，確定了M-K作為母離子；對于阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖和納他霉素來說，確定了M-H作為母離子，通過直接接二通的方式做了MRM自動優化，得到了定量離子、定性離子、Q1預桿電壓、碰撞電壓(CE)、Q3預桿電壓，優化結果見表2。在Pro-scan掃描時，每種甜味劑選擇兩個響應最強的子離子作為檢測的二級子離子，其中豐度高且穩定的離子作為定量離子，并最終確定了甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉和雙乙酸鈉的定量離子。

2.5 回收率和精密度

從市面上隨機選取了飲料、休閑食品(小魚仔)、糕點3種典型樣品，在空白樣品中分別加入3種質量濃度的甜味劑和防腐劑標準溶液，按上述試驗條件進行加標回收試驗，每個添加水平重復測定6次，計算添加平均回收率和相對標準偏差，結果見表3。從表3可以看出：6種甜味劑和5種防腐劑的平均回收率在73.4%～96.8%，相對標準偏差在1.6%～7.8%。該方法的準確度和精密度均滿足多殘留分析的要求。

2.6 方法的線性范圍和檢出限

對6種甜味劑和5種防腐劑的質量濃度在10～1 000 μg/L 的混合標準溶液進行了測定，得到了一系列質量濃度的色譜圖，以各甜味劑和防腐劑的色譜峰面積y為縱坐標，以各甜味劑和防腐劑的質量濃度x(μg/L)為橫坐標，作線性回歸方程，以10倍信噪比(S/N≥10)對應的空白樣品添加質量濃度作為方法的定量限(LOQ)，得到的線性范圍、回歸方程，線性系數R2和定量限見表4。結果表明：線性關系良好，相關系數(R2)都在0.996 以上，經樣品添加試驗確定空白樣品中這11種化合物的定量限為1.52～5.04 μg/kg。

表2 6種甜味劑和5種防腐劑標準物質的保留時間和質譜參數Table 2 The retention time and MS parameters of six kinds of sweeteners and five kinds of preservatives

表3 不同食品中6種甜味劑和5種防腐劑的回收率和精密度試驗Table 3 The results of the recoveries and RSDs of six kinds of sweeteners and five kinds of preservatives in different foods (n=3)

3 結論

試驗采用HPLC-MS/MS分析技術，綜合應用了高效液相色譜的高分離能力，利用質譜具有質量范圍寬、定性準、高特異性和高靈敏度的特點，能在較短的分析時間內對多組分進行一次性定性和分離，建立了一種食品中多組分甜味劑和防腐劑同時快速測定的方法。研究建立了高效液相色譜—串聯質譜法同時對食品中甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜6種甜味劑和納他霉素、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉5種防腐劑進行定性、定量的確證分析方法。其主要優勢在于目標分析物無需衍生且無需凈化過柱就可直接測定，縮減了樣品前處理時間，節約了試驗成本；采用液相色譜—串聯質譜分析技術，可以顯著提高結果的準確性和檢測的靈敏度，同時還減少了檢測中出現的假陽性現象；彌補了標準只針對單個或兩種甜味劑或防腐劑檢測的不足之處。由于試驗的6種甜味劑和5種防腐劑，除納他霉素外，均易溶于水，但納他霉素能很好地溶于甲醇，故試驗時樣品前處理先用甲醇超聲提取后，再用水超聲、定勻、搖勻后離心靜置取上清液過濾上機即可(對于含蛋白質的樣品還需加乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白質)。試驗結果表明：該方法前處理簡單、分析速度快、重現性好、準確度高和靈敏度高，有較強的實用性，為各類食品中多種甜味劑和防腐劑的檢測提供了一種可靠且準確的方法。

表4 6種甜味劑和5種防腐劑的標準曲線參數Table 4 The calibration curve’s parameters six kinds of sweeteners and five kinds of preservatives

利用高效液相色譜—串聯質譜分析技術建立食品中多組分食品添加劑同時測定并進行確證的方法，將成為食品安全質量檢測的發展方向之一，能夠滿足食品中多種甜味劑和防腐劑殘留的痕量分析要求，與國標[10-11]方法相比，大大提高了分析效率并降低了分析成本。