基于光電倍增管的管式發光檢測儀的設計與開發

王衛偉

（廣州博鷺騰儀器儀表有限公司，廣州 510006）

0 引言

生物發光和化學發光在生物分子學研究方面應用越來越廣。常用的檢測方法有成像法和光子計數法，兩者相比，光子計數法具有靈敏度高、檢出限低、動態范圍寬的特點[1]。

目前國內研究生物發光檢測儀器的多以ATP為檢測對象，但是在ATP濃度與生物發光強度之間的線性關系和檢出限都一般[2-3]，試劑消耗成本高，經濟效益差，數據的可靠性也不高。本文作者設計開發了一種基于生物發光和化學發光原理的多功能管式發光儀，通過設計更好的光電倍增管外圍電路，能夠實現更低檢出限，更好線性檢測。通過樣機測試，達到了預期效果，產品試用也得到用戶的認可。

1 基本原理及應用

1.1 生物發光與化學發光原理及應用

生物發光常用的試劑是螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶，螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能發光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelen?terazine）和氧氣。螢火蟲熒光素酶與ATP作用機理如下[4]：

ATP是各種活體生物能量的主要來源，利用熒光素酶則能檢測超微量10-16mol/L的ATP，上述這個特性決定了熒光素酶與ATP能構成很好的生物傳感器[5-6]，用于多種生物檢測。

化學發光常用試劑是魯米諾（Luminol）及其衍生物，在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在辣根過氧化物酶（HRP）的作用下，發出熒光，其化學發光反應式如圖1所示。

圖1 魯米諾化學反應式

辣根過氧化物酶作為廣泛應用的標記用酶，通過與魯米諾組合，其應用也十分廣泛?；谝陨仙锇l光和化學發光原理，設計了一款能夠檢測微弱光的管式發光檢測儀，其應用如下。

（1）報告基因分析

在基因調控及藥物研發的基礎實驗中，使用熒光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、堿性磷酸酶以及成為獲得高靈敏度檢測的標準方法[7-9]。特別是雙重化學發光分析技術，例如雙熒光素酶報告基因分析法，已經成為備受歡迎的技術手段，因為它可實現細胞轉染效率的內部控制，達到基因大量表達的技術水平。

（2）半胱天冬酶測定

檢測半胱天冬酶的行為（a group of cysteine-aspartic acid peptidases）是研究細胞凋亡的重要方法[10-11]。這類實驗主要圍繞半胱天冬酶3、7、8、9特定的多肽底物設計，在酶存在時多肽會被分解，從而顯示細胞處于凋亡期。生物發光技術可以完成此類實驗，通過標記發光底物Luciferin，在Luciferin催化下發出光信號來指示半胱天冬酶的存在。

（3）ATP檢測

基于熒光素酶反應產生發光的ATP實驗，由于所有活細胞中均包含ATP，因此可通過檢測ATP，實現細胞凋亡、細胞增殖實驗或者細菌檢測與分析[12]。

（4）水樣毒性分析

當生物發光菌，如Vibrio fischeri，接種到含有毒物水樣時，它們失去了依賴于水樣毒性的發光能力[13]。

（5）發光底物進行免疫分析[14-16]

通過改變辣根過氧化物酶或磷酸酶的發色底物為發光底物，會使檢測精度提高百倍。

（6）化學發光檢測

魯米諾（Luminol）及其衍生物，吖啶酯、AMPPD等發光檢測[17]。

1.2 PMT的基本原理

光電倍增管是一種真空管，如圖2所示，它由入射窗、光陰極面、倍增系統和陽極等組成。入射光穿透入射窗到達光陰極面，激勵光陰極面的光子向真空中放出電子（外光電效應），光子經聚焦極匯集到第一倍增極，然后再相繼經過各倍增管極（發射二次電子），進行二次電子倍增，最后由末級倍增極發射二次電子通過陽極輸出。

圖2 端窗式光電倍增管的構造圖

二次電子發射系數δ是倍增極間電壓E的函數，可用下式表示：

通常把入射到第一倍增極有效部分的光電子的幾率稱為收集效率（α），α為常數，k由電極的結構和材料決定，一般在0.7～0.8的范圍。

從光陰極面發射的光電流Ik，入射到第1倍增極，發射出二次電子流Id1，這時對于第1倍增極的二次發射系數δ1可用，表示為：

該電流從第1倍增極到第2倍增極，直到第n倍增極連續倍增。第2倍增極以后n級的二次電子發射系數δn可用下式表示：

陽極電流由下式給出：

式中：α為收集效率，把α·δ1·δ2…δn叫做電流增益，用μ表示：

若α=1，光電倍增管倍增級數為n，均分壓時，電流增益μ對工作電壓V的變化有以下關系式

由A=α（n）kn為常數可知，電流增益與工作電壓的kn次方成正比。

PMT的工作電壓通常為1～2 kV，光電倍增管倍增級數一般在10級以上，因此經過逐級倍增之后，PMT的增益可達百萬以上，滿足對單個光子的測量要求，因此可以實現超微量的生物發光和化學發光的檢測。

基于以上生物應用和光電倍增管原理，開發了一款管式發光檢測儀，最小檢測體積可達10μl，檢測靈敏小于20 amol ATP，可使用1.5 mL、2 mL的Eppendorf管或者12 mm×60 mm、12 mm×55 mm、12 mm×47 mm的試管。

2 系統設計

本發光檢測儀包括PMT及其外圍電路，濾波電路，放大器，甄別器，計數器，控制模塊以及人機交互界面，如圖3所示。生物試劑或者化學試劑發生反應產生的光子信號，經過PMT轉化后通過陽極輸出為脈沖電流信號，經濾波電路與放大電路進行電壓轉換，信號放大后送到脈沖高度甄別器，再進入計數器進行脈沖計數，并通過顯示屏顯示計數值，即樣品發光強度。

人機交互界面即電容式觸摸顯示屏，除了能顯示樣品發光強度以外，也可以通過顯示屏輸入檢測時間參數，如檢測開始間，檢測時長等。

圖3 系統方案

2.1 PMT選型

光電倍增管的倍增極有許多種類，如環形聚焦型、盒柵型、直線聚焦型、百葉窗型等等，由于它的結構、級數的不同而使得電流增益、時間響應特性、均勻性、二次電子收集效率特性等不同，另外其電氣特性不僅取決于倍增極的種類，還與光陰極面大小和聚焦系統有關，因此要根據使用目的作相應的選擇，光電倍增管倍增極特性如表1所示。

表1 各種倍增極的特性[1]

本設計主要是用來做生物發光或化學發光檢測的，由于實驗使用試劑多數比較昂貴，超微用量，因此試劑光信號非常弱，所以需要高收集效率的光電倍增管，基于這個原因選擇高收集效率的盒柵型光電倍增管，另外其均勻性等特點也滿足要求。推薦型號為英國ET公司9124B，日本濱松CR110等。

2.2 PMT外圍電路

PMT的外圍電路包括高壓電路和偏置電路[18]。光電倍增管對高壓供電電源和偏置電壓的穩定性要求比較高，在精密光輻射測量中，通常要求電源的穩定度達到0.01%～0.05%。PMT廠家一般有相應的標準模塊出售，如高壓電路模塊、偏置電路模塊、高壓電路及偏置電路模塊以及信號調理電路等單個或者組合模塊。因此常規應用，可根據需求直接采購標準模塊，如果追求至極性能，又想控制成本，可以考慮自己開發。本產品由于是針對的生命科學研究領域，更高的性能是首選，因此全部自己開發。

追求PMT更高的性能情況下，要求PMT輸出電流穩定在1%以內，而高壓電源的穩定性則必須優于0.1%。具體實施方案如下：首先通過數字電位器將系統電源變成輸出可調的電壓信號，再經過電流放大器將功率放大，接著通過多諧振蕩器將直流信號自激轉變為方波信號，再經過變壓器與倍壓電路升壓轉換成高壓脈沖信號，然后通過濾波電路將高壓脈沖信號轉變為直流信號，最后將高壓直流信號加載到PMT偏置電路上，為PMT倍增極提供電源。通過控制器（如單片機）調整數字電位器的輸出電壓值，即可調節PMT高壓電路輸出高壓值的大小，以解決同型號PMT，高壓值存在偏差的問題。電源方案如圖4所示。

圖4 直流高壓電源方案

偏置電路方案可以分為兩類，分別是無源偏置電路和有源偏置電路。無源偏置電路由電阻組成，由于PMT的工作電壓高達千伏，且其增益線性必須保證1%的精度，因此分壓器微安級的電流，必須使用高阻值大功率電阻，這樣導致偏置電路的體積過大，且發熱量過大。由于偏置電路的直接與PMT管腳相連，其熱量易通過金屬管腳導入PMT，進而增加PMT的熱噪聲，影響儀器檢測下限。常用的有源分壓為晶體管與電阻構成的偏置電路，二極管和電容組成的整流器偏置電路，以及場效應管與電阻構成的偏置電路，其中以場效應管與電阻構成的偏置電路的偏置電壓線性度和穩定性更好，因此選用場效應管與電阻構成的偏置電路，如圖5所示的正高壓場效應管偏置電路。實測時，陽極電流不超過50μA，增益線性滿足小于1%的要求。

圖5 場效應管與電阻構成的偏置電路

2.3 信號調理電路

PMT的高壓電路接線方式分為陽極接地和陰極接地。在光子計數的條件下，是讓接地的發光體與PMT光電面緊密貼在一起，為此采用陰極接地，陽極接高壓的方法。這時，為了使陽極加的正高壓信號與光子產生的電脈沖信號分離，通過使用耦合電路，隔離直流高壓信號，只允許光子產生的脈沖信號通過。特別注意的是，為保證不受耦合電容的影響，輸入波形不失真地傳達到輸出波形，回路的時間常數CR（R是Ra、RL的并聯電阻）必須比陽極輸出脈寬大數十倍以上。

如圖6所示，經耦合電路隔離直流高壓信號以及通過PMT輸出負責電阻RL將PMT輸出的電子流信號轉換為電壓信號后，PMT輸出的脈沖信號進入放大器，將脈沖信號放大，接著進入比較器，通過設定的閾值，將模擬脈沖信號轉變為數字脈沖信號，再經過計數器，然后進入控制器并通過顯示屏顯示數據。

圖6 PMT信號調試電路

PMT輸出脈沖信號的上升時間小于10 ns，因此需要選擇高頻大帶寬的放大器，如日本Renesas的HFA1109、EL5462。比較器可選用美國Maxin的MAX9201，比較器電路一般設有低甄別閾值（LLD）和高甄別閾值（ULD），放大器輸出脈沖與閾值進行比較，這樣既可以排除（甄別）掉脈沖幅度比LLD低的脈沖，也可以排除（甄別）掉脈沖幅度比ULD高的噪聲，但是通常情況下只設置地甄別閾值脈沖即可滿足要求。

PMT可輸出高達百萬脈沖/秒，且常用單片機的工作頻率基本都在100 MHz以下，因此在數字脈沖信號進入單片機之前，先經過高速計數器對脈沖進行計數，以滿足常規單片機的使用。單片機接收到計數值以后，通過顯示屏顯示樣品發光值，另外計數器電路設計有門電路，因此可以通過顯示屏設定任意測試時間，包括開始時間，測試時長等。

3 ATP實驗測試及結果分析

3.1 實驗內容

（1）標準ATP液濃度

原倍ATP液濃度：10-7M=1.0×10-13mol/μL。用ATP-Free Water進行稀釋配置不同ATP濃度標準液（注意：由于ATP原液濃度檢測讀數并不是很高，所以稀釋濃度梯度未設置為10，而是以3為梯度來稀釋） 。

（2）反應體系

每管：100 μL 各濃度梯度ATP 標準品+100 μL Re?agent。

（3）檢測方法

每個樣本逐個檢測，檢測參數：counting 5 s。靈敏度計算公式：每孔檢出極限=ATP標準液濃度×體積×（3×空白值標準偏差） /（標準樣品讀數-空白孔平均值）。

3.2 實驗結果及分析

從圖7所示的ATP實驗數據擬合曲線I和II中，可知在5.2×10-18～1.0×10-13之間取值的話，R2=0.995 3，線性良好；在1.5×10-17～1.0×10-13之間取值的話，R2=0.999 96，線性優秀。數據線性與某進口品牌檢測結果相差不大，也驗證了儀器設計達到了要求。

取1.4×10-16mol/μL檢測數據，來計算靈敏度：

靈敏度=（1.4×10-16×100×3×0.47）/（1 534-128） =0.14×10-16(mol)，即14 amol ATP。

但是目前國際上性能最好的設備，檢測靈敏度可達個位數的amolATP。靈敏度上還有差距，而且在低濃度時，線性不夠好。初步診斷為光路對樣品發光的收集效率不夠高，目前光路方案使PMT僅能收集發光樣品一個側面的光，無法將樣品發出的光全部收集起來，接下來將參考積分球原理，對光路進一步優化。

圖7 ATP實驗數據擬合曲線

4 結束語

通過研究光電倍增管的特性及其與生物研究應用的結合的特點，開發了一款基于單光子計數器的管式發光檢測系統。系統包括單光子計數器（光電倍增管）、放大器、甄別器、分頻器、計數器以及顯示屏。通過實驗測試，儀器的靈敏度及線性關系達到了設計要求，性能基本上達到了國際一線水平，后續將進一步優化，使儀器有更高的靈敏度和更好的線性。