菠蘿皮渣生產優質高菌體蛋白飼料發酵菌種的篩選及發酵條件的優化

陳間美 李晉禎 何曉彤 王玲

摘要：分別以熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母、綠色木霉、黑曲霉為出發菌株對菠蘿皮渣生產優質高菌體蛋白飼料進行發酵優良菌種的篩選試驗，以發酵產物中的粗蛋白含量為考核指標，篩選出1～2株優勢菌株;將篩選出的優勢菌株按一定比例混合使用，對菠蘿皮渣進行固態發酵生產菌體蛋白飼料，研究了接種量、料液比、溫度、發酵時間等對發酵產物理化品質及感官指標的影響。結果表明，綠色木霉和產朊假絲酵母為試驗的較優菌種;將綠色木霉與產朊假絲酵母1∶1體積比混合種子液使用對菠蘿皮渣進行固態發酵：混合菌種總接種量10%，料液比1∶3，發酵溫度30 ℃，發酵時間96 h為最優發酵條件。此工藝條件下，菠蘿皮渣發酵所得的蛋白飼料產物的粗蛋白質含量最高、氣味也比較好。

關鍵詞：菠蘿皮渣;菌體蛋白飼料;菌種的篩選;發酵條件優化

中圖分類號：S816.3???? 文獻標志碼：A??? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.014

Fermentation Strains Selection and Fermentation Paraments Optimization of

Protein Feed from Pineapple Pomace

CHEN Jianmei，LI Jinzhen，HE Xiaotong，*WANG Ling

（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

Abstract：To improve the content of crude ptotein in pineapple pomace，Candida tropicalis，Candida utilis，Trichoderma viride and Aspergillus niger were used as the starting strains to ferment pineapple pomace in this reserch from the above four strains. Using the crude protein content in the fermentation product as an indicator，one or two dominant strains were selected. The inoculum size，water-material ratio，fermentation temperature and fermentation time were important fermentation conditions in the fermentation process. The selected strains were mixed in a certain proportion to ferment pineapple pomace and carried out the optmiazation of the important fermentation conditions according to single factor experiment. The optimal fermentation conditions were obtained as followed：Trichoderma viride and Candida utilis were the best strains for this experiment;Trichoderma viride and Candida utilis were used as a mixed bacterial solution for the pineapple pomace fermentation in 1∶1 volume ratio：10%（V/W）inoculum size of the mixed bacterial solution，material water ratio 1∶3，fermentation temperature at 30 ℃ and cultivation for 96 h. Under the optimiazed conditions of the process，the fermented product had the highest crude protein content and pleasant flavor.

Key words：pineapple pomace;bacterial protein feed;strains selection;fermentation paraments optimization

0?? 引言

菠蘿（Ananas comosus），又名鳳梨，含有豐富的糖分、多種維生素和礦物質，廣泛分布于我國的廣東、廣西、云南等地。廣東西部的湛江是我國菠蘿的集中種植區，且產量大、品質好。目前，菠蘿加工的主要產品有罐頭、果醬和果汁等，菠蘿在加工的過程中會產生高達50%～60%的菠蘿皮渣。目前菠蘿皮渣僅有一小部分被直接利用作為飼料，絕大部分作為廢物丟棄，既浪費資源又對環境造成污染[1]。菠蘿皮渣含有豐富的營養成分，經過微生物發酵后可以提高其蛋白含量作為動物飼料[2]。王玲等人[3]用菠蘿皮渣釀制果醋。Contreras A等人[4]在奶山羊的飼料中添加菠蘿皮渣提取的菠蘿蛋白酶，改善了乳品質。梁耀開等人[5]發現，菠蘿皮渣混合菌種發酵可生產出高蛋白的畜禽飼料。葉盛權等人[6]成功開發出菠蘿皮渣飼料添加劑。

研究旨在對利用菠蘿皮渣生產出高菌體蛋白飼料進行菌種篩選[7-9]和對其生產工藝進行優化[10-15]。分別以熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母、綠色木霉、黑曲霉為出發菌株對菠蘿皮渣生產優質高菌體蛋白飼料進行發酵篩選優良菌種;以菠蘿皮渣為主要原料、豆粕和麩皮為輔料制備培養基，分別接入各出發菌株的擴大培養液，以發酵產物中的粗蛋白含量為考查指標，先進行單一菌種的篩選，再將得到的較優菌株進行混合使用，設計一定比例的接種量、料液比、發酵時間、發酵溫度4個因素對發酵工藝進行優化，以發酵產物的理化品質及感官指標來考查[16-18]，得到最優的發酵工藝條件，為利用菠蘿皮渣高效生產養殖業的高菌體蛋白飼料提供試驗依據。

1?? 材料與方法

1.1?? 試驗材料

1.1.1?? 原料與試劑

新鮮菠蘿皮渣，湛江鷹峰食品有限公司提供，于85 ℃下烘干后粉碎備用，按以下配方做成固體發酵培養基：菠蘿皮渣（干粉）70 %，麩皮22%，硫酸銨[（NH4）2SO4]3%，尿素[CO（NH2）2] 3%，KH2PO4 2%，料液比為1∶1（V/V）。

1.1.2?? 菌種

產朊假絲酵母、綠色木霉，廣東省微生物研究所菌種保藏中心提供。

熱帶假絲酵母、黑曲霉，廣東海洋大學食品科技學院微生物實驗室保存。

1.1.3?? 儀器與設備

高溫滅菌鍋、恒溫培養箱、生化培養箱、鼓風干燥機、無菌操作臺、半微式凱氏定氮儀等。

1.2?? 分析檢驗方法

1.2.1?? 水分含量的測定

采用國標GB 5009.3—2016常壓干燥法測定。

1.2.2?? 粗蛋白含量測定方法

采用國標GB/T 6432—2018凱氏定氮方法測定。

1.2.3?? 干物質得率及粗蛋白得率測定方法

在115 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中將發酵產物烘干后進行稱質量，通過計算依次得干物質得率、測蛋白得率。

粗蛋白得率 = 干物質得率 × 粗蛋白含量.

1.3?? 試驗方法

1.3.1?? 菌種活化

（1）產朊假絲酵母活化。首次活化用0.1～0.2 mL的無菌水溶解凍干管中的凍干粉，接種到2支麥芽汁瓊脂斜面培養基上，于26 ℃恒溫培養箱中培養48 h;然后將首次活化菌種在麥芽汁瓊脂斜面培養基上轉接活化2次，于4 ℃冰箱中保存備用。

（2）綠色木霉活化。首次活化用0.1～0.2 mL的無菌水溶解凍干管中凍干粉，接種到2支馬鈴薯斜面培養基上，于26 ℃恒溫培養箱中培養7 d;然后將首次活化菌種在馬鈴薯瓊脂斜面培養基上轉接活化2次，于4 ℃冰箱中保存備用。

（3）熱帶假絲酵母活化。挑取2～3環實驗室?? 4 ℃冰箱保存的熱帶假絲酵母接種到2支麥芽汁瓊脂斜面培養基上進行活化，于26 ℃恒溫培養箱中培養48 h，于4 ℃冰箱中保存備用。

（4）黑曲霉活化。挑取2～3環實驗室保存的黑曲霉接種到2支馬鈴薯斜面培養基上，于26 ℃恒溫培養箱中培養5 d，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2?? 菌種液體種子制備

（1）產朊假絲酵母菌種液。挑取2環新鮮活化的產朊假絲酵母到50 mL麥芽汁液體培養基中，在28 ℃條件下以轉速140 r/min振蕩培養箱中培養18 h。

（2）熱帶假絲酵母菌種液。挑取2環新鮮活化的熱帶假絲酵母到50 mL麥芽汁液體培養基中，在28 ℃條件下以轉速140 r/min振蕩培養箱中培養18 h。

（3）綠色木霉菌種液。挑取2環新鮮活化的綠色木霉到50 mL馬鈴薯液體培養基中，在28 ℃條件下以轉速140 r/min振蕩培養箱中培養24 h。

（4）黑曲霉菌種液。挑取2環新鮮活化的黑曲霉到50 mL馬鈴薯液體培養基中，在28 ℃條件下以轉速140 r/min振蕩培養箱中培養24 h。

1.3.3?? 固體發酵試驗

將培養好的液體菌種按設計好的接種量接種 到固體發酵培養基中，在一定的環境條件下進行發酵。

1.4?? 單一菌種篩選

按照固體培養基質量的10%分別接入產朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉的液體菌種液到固體培養基中，制成固體發酵培養物，每個試驗樣品設置3個平行組，另外設置一個空白對照組。在28 ℃恒溫箱中培養，2種酵母菌培養物培養3 d，其余2種霉菌培養物培養4.5 d。培養結束后，在115 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干發酵產物，測定發酵固體培養物的干物質得率、粗蛋白含量，計算粗蛋白得率后通過比較篩選得出蛋白質產量最高的各菌種。

1.5?? 混合菌種對菠蘿皮渣生產飼料蛋白發酵工藝優化

將篩選出的最優單一菌種的菌種液按1∶1體積比混合，接種到固體發酵培養物中。設計以不同的接種量、發酵溫度、料液比、發酵時間4個單因素分別對發酵工藝進行優化。

1.5.1?? 接種量條件優化

設置5個接種量梯度6%，8%，10%，12%，14%，其他條件菌保持一致：料液比為1∶1，溫度為28 ℃，發酵時間為72 h。每個處理設置3個平行組，設置一個空白對照組。以所測粗蛋白含量最高對應的參數為主，以感官指標最好對應的參數為輔，選擇最佳的接種量。

1.5.2?? 料液比條件優化

設置5個料液比梯度2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，其他條件保持一致：接種量為上述選出的最優參數，溫度為28 ℃，發酵時間為72 h。每個處理設置3個平行組。以所測粗蛋白含量最高對應的參數為主，以感官指標最好對應的參數為輔，選擇最佳的料液比。

1.5.3?? 發酵溫度條件優化

設置5個溫度梯度26，28，30，32，34 ℃，其他條件保持一致：接種量及料液比為上述選出的最優參數，發酵時間為72 h。每個處理設置3個平行組。以所測粗蛋白含量最高對應的參數為主，以感官指標最好對應的參數為輔，選擇最佳的發酵溫度。

1.5.4?? 發酵時間條件優化

設置5個溫度時間72，84，96，108，120 h其他條件保持一致：接種量、料液比、發酵溫度為上述選出的最優參數。每個處理設置3個平行組。以所測粗蛋白含量最高對應的參數為主，以感官指標最好對應的參數為輔，選擇最佳的發酵時間。

2?? 結果與分析

2.1?? 單一菌種篩選結果

采用產朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉這4種菌進行單一菌種篩選試驗，測定4種單一菌種對應的發酵產物的粗蛋白含量、干物質得率、粗蛋白得率。

單一菌種發酵產物的各指標含量變化情況見 表1。

由表1可知，以產朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉4種單一菌種及空白對照組進行固體發酵，每組設置3個平行組，表1中粗蛋白含量、干物質得率、粗蛋白得率為3個平行組的平均值。2種酵母菌（產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母）發酵產物各指標情況對比結果表明，粗蛋白含量為產朊假絲酵母高于熱帶假絲酵母，干物質得率為產朊假絲酵母低于熱帶假絲酵母，粗蛋白得率為產朊假絲酵母高于熱帶假絲酵母，因此生產優質蛋白能力更強的酵母菌為產朊假絲酵母。2種霉菌（綠色木霉、黑曲霉）發酵產物各指標情況對比結果表明，粗蛋白含量為綠色木霉高于黑曲霉，干物質得率為綠色木霉低于黑曲霉，粗蛋白得率為綠色木霉高于黑曲霉，因此生產優質蛋白能力更強的霉菌為綠色木霉。綜合4種菌及對照組的各指標情況可見，粗蛋白含量最高的2種菌依次為綠色木霉、產朊假絲酵母，粗蛋白得率最高依次為綠色木霉、產朊假絲酵母。由測定結果可知，單一菌種發酵效果越好，物料中粗纖維、糖類物質等被菌種利用轉換合成蛋白質的程度越高。因為產物的粗蛋白含量越高，干物質得率越低，最終的粗蛋白得率就越高。

根據上述綜合分析，綠色木霉為試驗的最優菌種，產朊假絲酵母次于綠色木霉，最終確定綠色木霉和產朊假絲酵母為試驗4種單一菌種中的最優菌種。

2.2?? 混合菌種對菠蘿皮渣生產飼料蛋白發酵工藝優化

2.2.1?? 接種量條件優化結果

按表1結果選出2種菌種的最優菌種分別為綠色木霉及產朊假絲酵母，將綠色木霉及產朊假絲酵母的菌種液按1∶1體積比混合備用。在料液比為1∶1，發酵溫度為28 ℃，發酵時間為72 h，綠色木霉和產朊假絲酵母按1∶1體積比，混合菌種液接種量分別為6%，8%，10%，12%，14%的條件下進行菠蘿皮渣的固態發酵。

接種量條件優化結果見圖1。

隨著發酵時間的推移，菠蘿皮渣固態發酵培養基發酵后蛋白質含量的高低與菌體接種量、固態發酵培養基的水分、溫度、發酵時間有著緊密聯系。在固態發酵培養基含水量、溫度和發酵時間一定的情況下，增大菌種接種量有利于提高菌體生長量，從而提高產品蛋白質的含量。

由圖1可知，菌種接種量在6%時菠蘿皮渣發酵產物中蛋白質含量很少，在接種量為10%之前蛋白質含量隨著菌種接種量的增加逐漸增加，當菌種接種量達到10%左右時，菠蘿皮渣固態發酵培養基中的蛋白質含量達到了最高水平，繼續增加接種量，蛋白質含量稍有下降但也趨于平穩，高于10%菌種接種量的發酵產物中蛋白質含量沒有明顯增加，可能與菌種發酵過程中從菠蘿皮渣固態發酵培養基中獲取的營養成分有限有關。從試驗結果及生產成本角度來看，在料液比1∶1，發酵溫度28 ℃，發酵時間72 h的條件下，產朊假絲酵母和綠色木霉按1∶1體積比混合菌種液，接種量10%為最佳的發酵條件。

2.2.2?? 料液比條件優化結果

在綠色木霉和產朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液，接種量為10%，發酵溫度為28 ℃，發酵時間為72 h，料液比分別以2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4的條件下進行菠蘿皮渣固態發酵。

料液比條件優化結果見圖2。

由圖2可知，菠蘿皮渣固態發酵培養基中水分含量對產物中蛋白質含量有很大影響，水是微生物生長必需的生長條件。在料液比為1∶3之前，蛋白質含量隨著水分含量的增加而增加，料液比在1∶3左右蛋白質含量達到最高水平，料液比1∶3后可能由于水分含量增加對微生物的生長繁殖起抑制作用，從而使發酵產物蛋白質含量下降。由此可見，在工藝生產過程中，從生產操作、節約成本角度出發，確定最佳的發酵料液比為1∶3。

2.2.3?? 發酵溫度條件優化結果

在綠色木霉和產朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液，接種量為10%，料液比為1∶3，發酵時間為72 h，發酵溫度分別為26，28，30，32，34 ℃的條件下進行菠蘿皮渣固態發酵。

發酵溫度條件優化結果見圖3。

由圖3可知，發酵溫度對微生物的生長影響很大，26 ℃時發酵產物蛋白質含量較低，微生物生長緩慢，固態發酵培養基中營養成分的利用率不高，隨著溫度的上升，產品蛋白質含量呈上升趨勢，當發酵溫度達到30 ℃時產品蛋白質含量達到最高，繼續提高培養溫度發酵產物則蛋白含量降低，菌種的發酵效果降低，這與菌種的生長受到溫度抑制有關，溫度過高可導致微生物的死亡。由此可見，發酵溫度控制在30 ℃左右時發酵效果最佳。

2.2.4?? 發酵時間條件優化結果

在綠色木霉和產朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液，接種量為10%，料液比為1∶3，發酵溫度為? 30 ℃，發酵時間分別為72，84，96，108，120 h的條件下進行菠蘿皮渣固態發酵。

發酵時間條件優化結果見圖4。

由圖4可知，隨著發酵時間的增加，產品蛋白質含量增加，當發酵時間達到96 h時達到最大值，繼續增加發酵時間，蛋白質含量略微下降且逐漸趨于平穩，導致蛋白質含量下降的原因可能是菠蘿皮渣固態發酵培養基中可提供微生物生長需要的碳源及氮源消耗完了，使最終發酵產物中的蛋白質含量偏低，也可能是由于霉菌發酵時間延長后形成了大量孢子，造成了負面的影響，從而使蛋白質含量的測定結果偏低。由此可見，發酵時間在96 h左右的發酵效果最佳。

2.3?? 品質檢測

經過最佳發酵條件（綠色木霉和產朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液，接種量為10%，料液比為1∶3，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為96 h）的發酵，將固態發酵培養基中的產品進行提取，通過物理和感官2個方面的測定，檢驗其品質。

發酵條件優化前后發酵產物粗蛋白含量對比見圖5。

發酵條件優化后，測定優化后發酵產物的粗蛋白含量——利用半微式凱氏定氮法測定其粗蛋白的含量為20.27%。由圖5可知，蛋白質含量從發酵條件優化前（沒有外加菌種，料液比為1∶1，發酵溫度為28 ℃，發酵時間為72 h）的4.05%提升到發酵條件優化后的20.27%。

產朊假絲酵母單一菌種的發酵產物有酸味，氣味不太宜人;產朊假絲酵母單一菌種的發酵產物有類似啤酒的酒精清香，氣味宜人。綠色木霉和產朊假絲酵母種子液1∶1體積比混合發酵的產物氣味宜人，有菠蘿的芳香。

3?? 結論

（1）試驗通過對熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母、綠色木霉、黑曲霉4種菌種進行單一菌種篩選，測定其粗蛋白含量、干物質得率、粗蛋白得率并進行綜合分析，發現綠色木霉和產朊假絲酵母為試驗4種單一菌種中的2株最優菌種。

（2）在單一菌種篩選試驗的基礎上，繼而進行混合菌種對菠蘿皮渣生產飼料蛋白發酵工藝優化的試驗，發現綠色木霉和產朊假絲酵母1∶1體積比混合發酵菠蘿皮渣生產菌體蛋白飼料的最佳工藝條件為接種量10%，料液比1∶3，發酵溫度30 ℃，發酵時間96 h。

（3）經過蛋白質含量測定及感官品質測定，發現發酵條件優化后產物的營養和感官都有極大提高，發酵條件優化后菠蘿皮渣發酵的蛋白質含量從4.05%提高到20.27%，可成為畜禽優質高菌體蛋白飼料。

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收稿日期：2019-10-19

基金項目：廣東海洋大學 2018 年地方高校國家級大學生創新訓練項目（CXXL2018009）。

作者簡介：陳間美（1997—?? ），女，本科，研究方向為食品質量與安全。

通訊作者：王?? 玲 （1965—?? ），女，碩士，副教授，研究方向為食品加工技術及食品微生物學方面的教學與研究。