健脾補腎方對再生障礙性貧血患者免疫功能、骨髓造血功能的影響

張琳琳 曹宇峰 呂麗麗 王磊 邊月平

再生障礙性貧血(AA)是多種病因引起的獲得性骨髓造血異常疾病，患者主要表現為骨髓造血功能障礙或衰竭、全血細胞減少。目前認為免疫功能失調、造血干/祖細胞和骨髓造血微環境損傷是AA的主要發病機制[1-3]。健脾補腎方能夠補腎填精、養血生髓，臨床用于脾腎虧虛引起的氣血不足、血枯髓空[4,5]。本研究觀察健脾補腎方對AA患者T淋巴細胞亞群、造血細胞因子的影響，進一步從MAPK/ERK信號通路角度探討其發揮治療作用的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2018年6月我院收治的90例AA患者，按照隨機數字表法隨機分為對照組和治療組，每組45例。對照組：男25例，女20例；年齡32～61歲，平均年齡(39.12±5.42)歲；病程1～12年，平均病程(5.12±0.73)年；中醫證候分型：脾腎陰虛型10例，脾腎陽虛型19例，脾腎陰陽兩虛型16例；治療組：男23例，女22例；年齡30～65歲，平均年齡(40.00±5.51)歲；病程1～14年，平均病程(5.78±0.82)年；中醫證候分型：脾腎陰虛型12例，脾腎陽虛型18例，脾腎陰陽兩虛型15例。2組年齡、性別比、病程和中醫證候分型比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=45

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合《血液病診斷及療效標準》制定的AA診斷標準，且經臨床癥狀體征、血常規指標、骨髓涂片及病理學檢查確診為AA；②符合《中藥新藥臨床研究指導原則》制定的中醫辨證分型診斷標準；③入組前2周內未接受過激素、化療藥物治療者；④患者自愿參加本研究，且簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①合并PNH、白血病等其他血液系統疾??；②合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者；③妊娠或哺乳期女性；④對本研究藥物過敏或有禁忌證者。

1.3 治療方法 對照組給予環孢素A(杭州中美華東制藥有限公司)治療，口服，4 mg·kg-1·d-1，2次/d；同時根據病情給予抗感染、補血及止血藥物。治療組給予健脾補腎方治療，組成：黃芪24 g，女貞子15 g，太子參24 g，白術芍15 g，炒丹皮15 g，制半夏10 g，小薊草15 g，菟絲子24 g，炒枳殼10 g，炙甘草6 g。1個月為1個療程，共治療2個療程。針對不同中醫辨證分型，健脾補腎方中分別配伍不同中藥，脾腎陰虛型可選擇滋陰生精的藥物，如生地黃、黃柏等；脾腎陽虛型可選擇填精助陽的藥物，如補骨脂、淫羊藿；脾腎陰陽兩虛型可選擇陰陽雙補的藥物，如杜仲、制首烏等。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 T淋巴細胞亞群：采用流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)測定外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)，計算CD4+/CD8+。

1.4.2 血常規指標：分別于治療前后抽取患者清晨空腹靜脈血3 ml，采用血細胞計數儀測定血紅蛋白(Hb)、紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血小板(PLT)。

1.4.3 造血細胞因子：采用酶聯免疫吸附實驗法(ELISA)測定血清促紅細胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、血管內皮生長因子(VEGF)水平。

1.4.4 MAPK/ERK信號通路蛋白表達：采用Western blot測定骨髓基質細胞p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白表達。骨髓基質細胞裂解后提取總蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg總蛋白上樣進行SDS-PAGE分離，電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，依次加入特異性一抗(1∶1 000稀釋)和辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)。室溫孵育1 h。PBS洗膜3次，以GAPDH為內參照基因，ECL發光后采用Image-Pro Plus軟件分析目的條帶的相對表達量。

2 結果

2.1 2組外周血T淋巴細胞亞群比較 治療前2組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明顯高于治療前，CD8+均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+高于對照組，CD8+低于對照組(P<0.05)。見表2。

組別CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+對照組 治療前63.68±4.5726.05±2.6735.00±4.310.78±0.09 治療后68.97±6.33*30.43±3.73*30.14±3.63*1.18±0.14*治療組 治療前64.22±5.2125.68±3.1034.78±4.230.80±0.11 治療后77.52±7.85*#38.43±4.35*#24.97±2.98*#1.39±0.18*#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.2 2組血常規指標比較 治療前2組Hb、RBC、WBC、PLT比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組Hb、RBC、WBC、PLT均明顯高于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組Hb、RBC、WBC、PLT高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

組別Hb(g/L)RBC(×1010g/L)WBC(×109g/L)PLT(×109g/L)對照組 治療前51.47±7.2318.76±2.572.05±0.3134.41±4.78 治療后85.20±9.54*32.21±4.50*3.32±0.46*55.25±6.31*治療組 治療前50.62±6.9319.14±2.932.09±0.3335.12±5.02 治療后103.79±10.71*#43.68±6.27*#3.99±0.52*#69.29±8.73*#

注：與治療前比較,*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.3 2組血清造血細胞因子水平比較 治療前2組血清EPO、TPO、VEGF水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組血清EPO、TPO水平均明顯低于治療前，VEGF水平均明顯高于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組EPO、TPO水平低于對照組，VEGF水平高于對照組(P<0.05)。見表4。

組別EPO(U/L)TPO(pg/ml)VEGF(pg/ml)對照組 治療前40.53±5.82267.09±36.6446.42±5.56 治療后30.14±4.16*188.57±23.12*69.37±8.23*治療組 治療前39.78±5.57271.33±38.3447.13±5.78 治療后19.35±2.84*#89.65±11.23*#110.68±13.75*#

注：與治療前比較,*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.4 2組骨髓基質細胞MAPK/ERK通路蛋白表達比較 治療前2組骨髓基質細胞p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組骨髓基質細胞p-ERK蛋白表達均明顯高于治療前，p-JNK、p-P38蛋白表達均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組p-ERK蛋白表達高于對照組，p-JNK、p-P38蛋白表達低于對照組(P<0.05)。見表5。

組別p-ERKp-JNKp-P38對照組 治療前0.44±0.061.09±0.150.96±0.12 治療后0.69±0.10*0.77±0.10*0.69±0.09*治療組 治療前0.42±0.051.11±0.170.93±0.10 治療后1.12±0.16*#0.38±0.06*#0.35±0.05*#

注：與治療前比較,*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

3 討論

中醫認為AA是由于外邪和內傷等原因引起的氣血虧虛、諸臟失養以及髓脈空虛，因而出現血虛證候。血虛時心、肝、脾、腎等臟器受損，其中脾腎虧虛是導致氣血不足、精不化血的根源。因此，AA治療應以培補脾腎、益氣生血為主。本研究根據中醫學觀點，從補益脾腎角度出發，將健脾補腎方應用于AA患者的臨床治療中，諸藥合用能夠達到填髓生血，化氣生血的治療目的。

研究表明，骨髓造血干/祖細胞數量減少和功能缺陷導致骨髓造血細胞生成障礙、造血能力下降是AA的主要發病機制，而免疫異常又引起VEGF等造血負調控因子分泌失調和骨髓造血干/祖細胞凋亡，進一步加重AA，患者表現為外周血象異常，即Hb、RBC、WBC、PLT明顯下降[6]。骨髓造血是與多種因素有關的復雜過程，其中造血因子在骨髓造血過程中發揮重要調控作用。EPO、TPO主要是由骨髓基質細胞、肝細胞、腎小管細胞合成分泌的細胞因子，EPO與紅細胞膜受體結合后主要發揮促進紅細胞增殖、分化、成熟并增加外周血紅細胞數量等作用，TPO與血小板膜受體結合后能夠調控正常骨髓造血干細胞功能[7]。近年來研究發現VEGF不僅能夠促進血管生成并增加血管通透性，對造血功能也具有間接調控作用[8,9]。國內外研究發現AA患者血清EPO、TPO水平較健康人明顯增高，VEGF水平較健康人明顯降低，隨著病情好轉EPO、TPO水平逐漸降低，VEGF水平逐漸升高，提示與EPO、TPO水平與骨髓造血功能障礙程度呈正相關，VEGF水平與骨髓造血功能障礙程度呈負相關[10-13]。本研究結果表明，治療后2組Hb、RBC、WBC、PLT及血清VEGF水平均明顯高于治療前，血清EPO、TPO水平均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組Hb、RBC、WBC、PLT、VEGF高于對照組，EPO、TPO低于對照組(P<0.05)，提示健脾補腎方治療AA能夠更加有效的調節造血因子分泌，從而改善患者外周血象。

MAPK是將細菌復合物、炎性因子等細胞外刺激信號傳遞到細胞核中的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞增殖、分化、凋亡等生理過程中發揮關鍵調控作用[14]。MAPK家族信號通路包括ERK、JNK/SAPK和P38三條信號通路，其中ERK信號通路的主要功能是促進細胞增殖、分化并抑制細胞凋亡，而JNK/SAPK和p-P38是調控細胞應激反應及促進細胞凋亡的重要通路[15]。本研究顯示，p-ERK是ERK的活性形式，主要通過以下機制發揮抗凋亡作用：(1)促進增殖相關轉錄因子AP-1及抗凋亡細胞因子Bcl-2的活化，從而促進細胞增殖并抑制細胞凋亡；(2)促進細胞周期相關蛋白CDK2、CDK4的活化，促使細胞周期進入G1和S期，因而抑制細胞凋亡[16]。動物實驗結果顯示，AA小鼠骨髓基質細胞MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達明顯下調，提示MAPK/ERK信號通路參與AA的發生發展。臨床研究也表明，骨髓機制細胞p-ERK蛋白表達較健康人明顯降低，p-JNK和p-P38蛋白表達較健康人明顯增高，說明ERK信號通路的激活與造血干/祖細胞的增殖和分化有關[17-19]。本研究結果表明，治療后2組骨髓基質細胞p-ERK蛋白表達均明顯高于治療前，p-JNK、p-P38蛋白表達均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組p-ERK蛋白表達高于對照組，p-JNK、p-P38蛋白表達低于對照組(P<0.05)。我們推測p-ERK蛋白表達降低造成其對AP-1等下游轉錄因子調控作用減弱，從而影響造血干/祖細胞的增殖和分化，并促進造血干/祖細胞凋亡，因而導致AA發生發展，而健脾補腎方通過上調p-ERK蛋白表達、下調p-JNK、p-P38蛋白表達促進骨髓造血功能的恢復，升高外周血象，這可能是健脾補腎方發揮治療作用的機制之一。

綜上所述，健脾補腎方治療AA療效顯著，能夠有效調節患者免疫功能和造血細胞因子分泌，從而促進骨髓造血功能恢復。MAPK/ERK信號通路的激活在AA發病過程中發揮重要作用，健脾補腎方可能通過調控MAPK/ERK信號通路，促進骨髓造血功能的恢復。