TBX2對人膠質瘤細胞U251生物行為學的影響

劉中平 劉小江 吳德模

腦膠質瘤(glioma)是位于神經外胚層的腫瘤，約占顱內腫瘤的46%，在顱內呈浸潤性生長，主要表現為浸潤性侵犯血管周圍間隙、神經纖維束間及軟腦膜，具有侵襲性強及易復發的特點，是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一[1]。膠質瘤的發病機制目前尚未完全清楚，通常認為膠質瘤的發生是由促癌基因或抑癌基因共同參與的多因素、多步驟的復雜過程[2]。T-BOX轉錄因子2(T-box transcription factor 2，TBX2)是T-BOX基因家族成員之一，其編碼的TBX2蛋白可以作為轉錄因子調控胚胎發育過程[3]。研究發現，TBX2可通過多種機制促進腫瘤的發生與發展[4]。張雁等[5]研究表明，TBX2在卵巢癌等多種腫瘤中表達上調，是一種新型腫瘤分子標志物。但目前關于TBX2對腦膠質瘤細胞生物學行為的影響研究筆者尚鮮見報道。本研究通過體外培養腦膠質瘤細胞，探討TBX2對腦膠質瘤細胞生物學行為的影響，以期為腦膠質瘤的臨床治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質瘤細胞U251及正常人星形膠質細胞SVG P12均購自上海酶聯生物科技有限公司，DMEM培養基、胎牛血清購自賽默飛世爾科技有限公司，慢病毒載體由南京科佰生物科技有限公司設計并構建。

1.2 細胞培養及分組 人腦膠質瘤細胞U251接種在含10%的新生牛血清的DMEM培養液中，置于37℃飽和濕度、5% CO2培養箱中進行培養，每隔2 d更換一次培養基，取增殖期的細胞，胰蛋白酶消化后接種于6孔板中繼續培養，培養至細胞融合度70%左右時，將細胞隨機分為3組，TBX2 inhibitor組：轉染含TBX2 inhibitor的慢病毒載體；陰性對照組(NC組)：轉染攜帶無義序列的慢病毒載體；空白對照組(CK組)：不進行轉染。37℃培養箱中繼續培養48 h，收集3組細胞。

1.3 qRT-PCR檢測腦膠質瘤細胞中TBX2表達水平 取膠質瘤細胞500 μl，采用Trizol法提取樣品總RNA，測定RNA純度及濃度后，采用反轉錄試劑盒反轉錄得cDNA，再以cDNA為模板進行擴增，以GAPDH作為內參，反應體系25 μl，qRT-PCR反應條件：95℃：5 min；94℃：30 s；58℃：45 s；72℃：30 s，共35個循環。采用2-CT法測量TBX2表達水平。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 細胞增殖檢測 采用CCK-8 法進行檢測，分別將轉染48 h的3組細胞分別接種于96孔板，每組細胞設6個復孔，每孔接種5×103個細胞，在培養0 h、12 h、24 h、48 h、72 h時加入10 μl CCK8溶液，置于37℃、5% CO2培養箱孵育2 h后，在450 nm波長處讀取吸光度值(OD值)，并求取平均值。

1.5 細胞遷移情況 采用Transwell細胞遷移實驗進行檢測，收集轉染后48 h細胞制備2×103/μl單細胞懸液，取100 μl接種于上室(每組設3個復孔)，下腔室中加入含有10% FBS條件培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育24 h，取出Transwell小室，吸棄上室液體，用PBS洗2次，95 %乙醇固定10 min，加入0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗2遍，顯微鏡下隨機選取10個視野，觀察并拍照，利用Image J軟件計數穿膜細胞數，求取平均值。

1.6 細胞侵襲情況 采用Transwell法進行檢測，檢測過程除加入基質膠外，其他步驟與細胞遷移檢測方法相同。

2 結果

2.1 TBX2在腦膠質瘤細胞中的表達情況 腦膠質瘤U251細胞TBX2相對表達量顯著高于SVG P12正常細胞(P<0.05)。見表2。

表2 腦膠質瘤細胞與正常細胞中TBX2表達比較

注：與SVG P12細胞比較，*P<0.05

2.2 轉染后3組腦膠質瘤細胞中TBX2表達比較 TBX2 inhibitor組腦膠質瘤細胞TBX2相對表達量顯著低于CK組、NC組(P<0.05)。見表3。

表3 轉染后各組腦膠質瘤細胞中TBX2水平比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與CK組比較，#P<0.05

2.3 轉染后3組腦膠質瘤細胞增殖情況比較 TBX2 inhibitor組腦膠質瘤細胞培養24 h、48 h、72 h的OD值均顯著低于CK組、NC組(P<0.05)。見表4。

表4 3組腦膠質瘤細胞增殖情況比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與CK組比較，#P<0.05

2.4 轉染后各組腦膠質瘤細胞遷移情況比較TBX2 inhibitor組腦膠質瘤細胞遷移數目顯著低于CK組、NC組(P<0.05)。見表5，圖1。

2.5 3組腦膠質瘤細胞侵襲情況比較 TBX2 inhibitor組細胞侵襲數目顯著低于CK組、NC組(P<0.05)。見表6,圖2。

3 討論

腦膠質瘤又稱神腦膠質細胞瘤，來源于神經膠質細胞和神經元，由間質細胞如神經膠質及脈絡叢上皮等形成，是顱內常見的一種惡性腫瘤[6]。按病理分級可將腦膠質瘤可分為4級，其中Ⅰ級腦膠質瘤繁殖能力低，手術治愈可能性高；Ⅱ級腦膠質瘤為浸潤性腫瘤，易復發，有向高級別腫瘤進展的傾向；Ⅲ級腦膠質瘤具有惡性腫瘤的組織學特點，多數患者需要接受術后輔助性放、化療；Ⅳ級腦膠質瘤具有惡性細胞學表現，生長迅速，術前、術后進展快，復發率高，患者術后需接受輔助性放、化療及生物治療等綜合療法，但目前臨床上仍無法治愈該疾病[7-9]。腦膠質瘤發病機制是涉及多個基因共同參與的復雜過程。其發病機制至今尚未完全明確，因此，進一步探索影響腦膠質瘤細胞生物學行為的因素十分重要。

表5 3組腦膠質瘤細胞遷移情況比較 個，

注：與NC組比較，*P<0.05；與CK組比較，#P<0.05

圖1 3組腦膠質瘤細胞遷移情況比較(結晶紫染色×200)

圖2 3組腦膠質瘤細胞侵襲情況比較(結晶紫染色×200)

表6 3組腦膠質瘤細胞侵襲情況比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與CK組比較，#P<0.05

TBX2是T-BOX基因編碼轉錄因子家族成員之一，在心、腎、肺、乳腺間質中均有表達，在早期胚胎形成和晚期組織器官的發育成熟中起著重要的調控作用[10]。研究發現，TBX2在腫瘤的發生過程中具有關鍵的作用，在黑素瘤等多種惡性腫瘤組織中表達上調[11]。常方圓等[12]研究表明，TBX2在惡性外周神經鞘膜瘤中表達上調，可能在惡性外周神經鞘膜瘤發生、發展中具有重要作用。本研究結果顯示腦膠質瘤U251細胞中TBX2相對表達量顯著高于SVG P12正常人星形膠質細胞，提示TBX2在膠質瘤細胞中表達上調，在膠質瘤疾病的發生中可能扮演促癌角色，TBX2表達上調可能與腦膠質瘤疾病的發生有關。

隨著分子生物學的發展，人們對腦膠質瘤發病機制的研究已經深入到基因水平，研究表明，IGF-2、YEGF、HIF-1、MDM2等原癌基因在腦膠質瘤組織中表達上調，而RB、p14、P53、PTEN等抑癌基因在腦膠質瘤中由于基因突變或缺失等原因表達受到抑制[13]。研究表明，TBX2能夠參與腦膠質瘤的形成與發展，主要通過表達p14ARF基因或抑制p21基因，導致MDM2過度表達，進而促進細胞增殖[14,15]。本研究結果顯示TBX2 inhibitor組細胞TBX2相對表達量顯著低于CK組、NC組，提示轉染TBX2 inhibitor后，腦膠質瘤細胞中TBX2顯著降低，轉染效率較高。

TBX2是腫瘤發生和發育過程中的重要細胞周期調節因子，Nandana等[16]研究表明，TBX2在前列腺癌標本和人類前列腺的異種移植小鼠模型的骨轉移中表達上調，使用顯性失活構建體抑制TBX2的表達，可導致腫瘤細胞增殖減少。Wang等[17]研究表明，在視網膜色素上皮細胞中特異性敲低TBX2的表達，可使大部分細胞在G1期積累，從而抑制視網膜色素上皮細胞增殖。本研究結果顯示TBX2 inhibitor組細胞培養24 h、48 h、72 h的OD值均顯著低于CK組、NC組，提示下調TBX2表達能夠抑制腦膠質瘤細胞增殖。腫瘤細胞的侵襲與遷移是腦膠質瘤疾病進展的關鍵，腫瘤的侵襲與遷移是一個涉及多個因子參與、多個步驟的復雜過程，包括腫瘤細胞的分離、運動、侵入其他組織及胞外基質的降解[18]。E-cadherin是促進細胞移動、癌細胞浸潤的一種蛋白。房前等[19]研究表明TBX2通過直接調控靶基因E-cadherin，提高癌細胞的侵襲與遷移能力。本研究結果顯示TBX2 inhibitor組細胞遷移數目顯著低于CK組、NC組，TBX2 inhibitor組細胞侵襲數目顯著低于CK組、NC組，提示下調TBX2表達可顯著抑制膠質瘤細胞的侵襲與遷移。

綜上所述，TBX2在腦膠質瘤細胞中表達上調，下調TBX2表達可抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移與侵襲，有望作為潛在靶標應用于靶向治療。然而本研究僅初步探究了TBX2在膠質瘤中的表達及其對膠質瘤細胞U251生物行為學的影響，其中涉及的具體分子機制將進一步深入研究。