陸常輝,桂王艷
(1.瀚暉制藥有限公司,浙江 杭州 310020;2.浙江海正藥業股份有限公司藥品研發QC,浙江 杭州 311404)
博來霉素為發酵來源的糖肽類抗腫瘤抗生素類藥物,適用于皮膚癌、頭頸部癌(上頜竇癌、咽部癌、唇癌等)、肺癌(特別是原發和轉移性磷癌)、食道癌等的治療[1]。博來霉素為多組分藥物,因此組分是藥品質量控制中重要的項目之一。本文參考相關文獻,建立了比各藥典標準更優的博來霉素組分檢查方法。方法經驗證,專屬性、線性、精密度和準確度等均符合要求,可保證組分檢查結果的準確性。
島津LC-20AD高效液相色譜儀,軟件LabSolutions色譜工作站;安捷倫1269高效液相色譜儀,軟件OpenLab色譜工作站;S220型pH計(METTLER TOLEDO公司),XP26型電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)。
注射用鹽酸博來霉素(浙江海正藥業股份有限公司,批號20BH03010、20BH03011、20BH03012);甲醇和乙腈均為色譜純,己烷磺酸鈉為高效液相色譜專用試劑,乙二胺四乙酸二鈉和氨水為分析純,水為純化水。
色譜柱:Agilent SB-C18(4.6mm×150mm,3.5μm);以己烷磺酸鈉溶液(取己烷磺酸鈉4.7g與乙二胺四醋酸二鈉1.86g,加0.08mol/L醋酸溶液使溶解并稀釋至1000ml,用氨溶液調節pH值至4.3)為流動相A;甲醇:乙腈(70:30)為流動相B;按表1線性梯度洗脫;柱溫為35℃;流速為每分鐘1.0ml;檢測波長為254nm;進樣量10μl。
表1 梯度洗脫程序
取本品適量,加水制成每1ml約含2500博來霉素單位的溶液,量取10μl注入液相色譜儀,按表1進行梯度洗脫。色譜圖中兩個主組分峰與各自相鄰雜質峰的分離度不小于1.0;理論塔板數按博來霉素A2峰計算,應不低于8000。
取本品,加水制成每1ml約含2500博來霉素單位的溶液,搖勻,精密量取10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖;按峰面積歸一化法計算博來霉素A2,博來霉素B2,博來霉素B4,去甲基博來霉素A2,去甲基博來霉素A2外其他雜質之和。
分別在1.10W/m2強光,0.5N鹽酸溶液,0.01N氫氧化鈉溶液,5%過氧化氫溶液,以及在40℃、75%RH條件下對樣品進行降解。進樣測試。
降解幅度最大的熱降解條件下樣品色譜圖見圖1,在擬定的色譜條件下,博來霉素的各組分及雜質均能有效分離,方法專屬性良好。
圖1 熱降解樣品溶液典型圖譜
此色譜條件下,博來霉素的檢測限為0.222 μg/ml,定量限為0.739 μg/ml;去甲基博來霉素A2的檢測限為0.242 μg/ml,定量限為0.805 μg/ml;博來霉素B4的檢測限為0.227 μg/ml,定量限為0.757 μg/ml。
配制線性梯度溶液,進樣檢測,博來霉素A2+博來霉素B2在定量限至2mg/ml范圍內呈良好線性,線性方程為y=4.9444x-2.7221(R2=1.0000);去甲基博來霉素A2在0.8 μg/ml~128 μg/ml內呈良好線性,線性方程為y=4.5821x-0.8333(R2=1.0000);博來霉素B4在0.75 μg/ml~30 μg/ml呈良好線性,線性方程為y=3.2560x-0.1221(R2=1.0000)。
將已知量的組分加入博來霉素中,再按面積歸一化法測定各自的量并計算回收率。結果表明在8.051μg/ml~120.770μg/ml的加樣范圍內,去甲基博來霉素A2的回收率范圍為92.5%~96.1%;在0.750μg/ml~30.019μg/ml的加樣范圍內,去博來霉素B4的回收率范圍為96.4%~103.4%;在8.051μg/ml~120.770μg/ml的加樣范圍內,去甲基博來霉素A2的回收率范圍為92.5%~96.1%;
重復性:配制6份加入雜質的供試品溶液,測定組分及雜質。結果顯示6份樣品溶液中博來霉素A2、博來霉素B2和博來霉素A2+博來霉素B2的RSD小于0.1%,其他總雜質的RSD小于3.2%,重復性符合要求;
中間精密度:在不同HPLC系統、不同批次的色譜柱,不同實驗人員及不同日期檢測重復性同批次樣品。并將結果于與重復性實驗對比,博來霉素A2、博來霉素B2及兩者的加和的差值在0.1%~0.2%之間。去甲基博來霉素A2、博來霉素B4,及除以上雜質外的其他雜質的和的差值不超過0.06%。證明方法具有良好的中間精密度。
采用以上方法測定海正藥業的三批注射用鹽酸博來霉素,博來霉素A2與博來霉素B2的和分別為95%、96%、95%;博來霉素B4均小于1%;去甲基博來霉素A2分別為1.0%、0.9%和1.2%;去甲基博來霉素A2外其他雜質之和分別為3.6%、3.4%、3.7%。
對比本方法與現行版美國藥典[2]、英國藥典[3]和日本藥典[4]收載的博來霉素相關組分方法,本方法能檢測出更多的雜質,有利于產品的質量控制。對比結果詳見表2。
表2 不同方法組分檢測結果對比