美洲南瓜枯萎病菌分離鑒定及其生物學特性

李金峰 劉佳 侯敏 張樹武 沈志彥 徐秉良 陳榮賢

摘 要： 通過采用病原菌形態學觀察、ITS分子鑒定、病原菌生物學特性測定，明確甘肅省武威地區美洲南瓜枯萎病的病原菌及其生物學特性。結果表明，引起甘肅省武威地區美洲南瓜枯萎病的病原為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）。該病原菌在25 ℃、12 h光暗交替，pH為8，以淀粉為碳源時生長最好。以硝酸鈉和尿素為氮源時其生長速率最快，以牛肉浸膏為氮源時最有利于產孢。美洲南瓜枯萎病的病原菌及生物學特性的明確，為后續的病害防治等方面提供了理論基礎。

關鍵詞： 美洲南瓜;枯萎病;分離鑒定;尖孢鐮孢菌;生物學特性

Abstact： In this study， morphological observation of pathogens， molecular identification of ITS， and determination of biological characteristics of pathogens were used to determine the pathogens and biological characteristics of Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province. The results showed that the pathogen causing Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province was Fusarium oxysporum. The fungi was alternated in light and dark at 25 ℃， 12 h， pH 8 and grew best when starch was used as the carbon source. When sodium nitrate and urea were used as nitrogen sources， the growth rate was fastest， and when beef extract was used as nitrogen source， it was most conducive to spore production. The pathogens and biological characteristics of the Cucurbita pepo Fusarium wilt disease provide a theoretical basis for subsequent disease control.

美洲南瓜（Cucurbita pepo）屬于葫蘆科南瓜屬（Cucurbita），別名為西葫蘆、番瓜等，原產于北美洲南部地區。因其含有多種營養成分，具有很高的食用和藥用價值，在我國大部分地區普遍栽培[1]。甘肅省武威市是美洲南瓜的重要育種研發和生產基地，也是當地重要的經濟作物之一[2]。

瓜類枯萎病是瓜類生產上最難防治的土傳性病害之一[3]，其中，以西瓜發病最重，南瓜次之，一般可導致減產20%～30%，嚴重時可達50%～60%，其中連作地的發病情況最為嚴重，?？蓪е氯餆o收，加之近年來枯萎病對美洲南瓜的危害日益嚴重，但其防治較為困難。因此，枯萎病的危害是瓜類生產上急需解決的重要問題[4]，也成為限制美洲南瓜生產的重要因素之一[5]。

研究表明，瓜類枯萎病的病原菌多為尖孢鐮孢菌[6]。引起甜瓜枯萎病的病原菌為尖孢鐮孢菌甜瓜?；虵usarium oxysporum f. sp. melonls[7]。徐彥剛等[8]研究表明，尖孢鐮孢菌黃瓜?；虵. oxysporum f. sp. cucumerinum是造成黃瓜枯萎病的病原菌。呂佩珂等[9]研究認為，尖鐮孢菌西瓜?；?F. oxysporum f. sp. niveum為侵害西瓜的枯萎病病原菌。但是，關于近幾年來甘肅省武威地區美洲南瓜枯萎病病原菌的相關報道相對較少。

明確病原菌的種類及其生物學特性是進行病害防治的基礎工作，因此，筆者對甘肅省武威地區的美洲南瓜枯萎病病原菌進行分離鑒定，并對其生物學特性進行研究，以期為美洲南瓜枯萎病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的美洲南瓜品種‘金蘋果12號‘金蘋果9號‘三星‘四星‘P3和‘P13均由甘肅省武威市金蘋果有限責任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病樣采集 2018年6月15日，在甘肅省武威市金蘋果有限責任公司種質資源試驗基地隨機采集美洲南瓜‘金蘋果12號‘金蘋果9號‘三星和‘四星品種的枯萎病發病植株共20株。將病樣帶回甘肅農業大學植物保護學院植物病毒與分子學研究實驗室進行分離鑒定。

1.2.2 美洲南瓜枯萎病病原菌分離與純化 供試培養基： PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂粉（進口）10 g，用水定容至1 000 mL，用于病原菌的分離純化培養。

CLA培養基：新鮮康乃馨葉片小塊滅菌后放入培養皿中，每皿5～10片，瓊脂粉（進口）10 g，加水定容至1 000 mL，用于病原菌大小型分生孢子的觀察培養。

Czapek培養基：1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、30 g蔗糖、0.5 g KCl、2 g NaNO3、瓊脂粉（進口）10 g、用水定容至1 000 mL，用于不同碳氮源對美洲南瓜枯萎病菌的培養。

組織分離法：用無菌水將病株樣品莖基部和根部沖洗干凈，用無菌濾紙將水分吸干，在超凈工作臺中將發病莖基部和根部的病健交界處切成5 mm×5 mm的小塊，將處理好的小塊用75%乙醇浸潤10 s，再用0.1%升汞溶液消毒2～3 min，然后用無菌水漂洗3次，用無菌濾紙吸干殘余水分。將此病健交界小塊采用五點法接于PDA平板上，然后將其放入恒溫培養箱中培養約3～4 d，溫度25 ℃，16 h光照/8 h黑暗，及時挑取根段周圍長出的菌落接種于新的PDA平板上，置于25 ℃培養箱中恒溫培養[10]。

待純化的菌落生長5～10 d，用無菌水沖洗菌絲表面，收集孢子或菌絲懸浮液，采用稀釋法進行單孢分離純化病原菌。待PDA平板上長出單菌落，用接種針挑取少量菌絲或孢子至新的PDA平板上培養，即獲得單孢或單菌絲分離物。

1.2.3 致病性測定 病原菌孢子懸浮液的配制：將分離得到的病菌在PDA平板上培養7 d后，用0.025%的吐溫80溶液和無菌水洗下孢子，用無菌的玻棒攪拌均勻，血球計數板觀察計數。配制成濃度為 1×105 個·mL-1孢子懸浮液備用。

首先對美洲南瓜種子進行催芽處理然后移入育種盤，等幼苗生長7 d后在其根部和莖基部制造微傷口，在傷口處噴灑分離得到的濃度為1×105 個·mL-1的病菌孢子懸浮液后，在恒溫培養箱中繼續培養，溫度25 ℃，16 h光照/8 h黑暗，以無菌水處理為對照，觀察并記錄[10]。待發病后取莖基部發病組織再次進行病原菌分離純化與鑒定。

1.2.4 病原菌的形態學鑒定 將病原菌在PDA平板上純化后用直徑為5 mm打孔器打取菌餅，接種于新的PDA平板和CLA平板上，每種病原菌6次重復，然后置于25 ℃恒溫培養箱培養。7 d后，觀察記錄培養于PDA平板上的病原菌菌落形態特征及培養皿背面著色情況。15 d后，挑取CLA平板上的菌絲在光學顯微鏡下觀察其大、小型分生孢子等，并進行拍照。參照Leslie J.F等[11]的方法對病原菌進行鑒定。

1.2.5 病原菌的分子生物學鑒定 參照OMEGA公司的HP Plant DNA Kit試劑盒說明書提取病原菌DNA，利用真核生物基因組中的rDNA-ITS區段通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4 （5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）對病原菌基因組DNA 進行PCR擴增[12]。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至西安擎科生物科技有限公司測序。將測序結果在NCBI網站的數據庫中比對測序結果，在線搜索同源性較高的已知序列，將序列信息導入MEGA 7軟件通過鄰接法（neighbor-joining）構建系統聚類樹，分析其親緣關系。根據比對結果，進行分子生物學鑒定。

1.2.6 溫度對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響 將美洲南瓜枯萎病菌接種于PDA培養基上，分別置于 5、15、20、25、30、35、40 ℃無光照保濕培養7 d，每處理5次重復。用十字交叉法每2 d測量1次菌落的直徑，取其平均值并計算菌絲平均生長速度。在培養7 d后，用無菌水洗下孢子制作成孢子懸浮液并將體積定容到10 mL，取50 μL孢子懸浮液滴于血球計數板上進行病原菌孢子計數[13]。

1.2.7 光照對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響 將已接種美洲南瓜枯萎病菌的 PDA 培養基分為3組，25 ℃持續光照培養96 h;25 ℃持續黑暗培養96 h;25 ℃黑暗12 h與光照12 h交替培養96 h，每處理重復5次。按1.2.6中的方法測量菌絲生長和產孢量。

1.2.8 碳源對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響 采用查彼（Czapek）培養基[14]作為基礎培養基，將美洲南瓜枯萎病菌分別接入以相同質量的麥芽糖、葡萄糖、淀粉、甘露醇和乳糖代替查彼培養基中的蔗糖的培養基中，并以不加碳源的培養基作為對照。室溫培養，每處理5次重復。7 d后觀察菌落形態和孢子形成情況并按照1.2.6中的方法測量菌絲生長和產孢量。

1.2.9 氮源對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響 將美洲南瓜枯萎病菌分別接入以相同質量氮的硝酸銨、尿素、氯化銨、硫酸銨和牛肉浸膏替代替基礎培養基中的NaNO3的培養基中，并以不加氮源的培養基為對照。室溫培養，每處理5次重復。7 d后觀察菌落形態和孢子形成情況并按照1.2.6中的方法測量菌絲生長和產孢量。

1.2.10 pH對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響 將美洲南瓜枯萎病菌接種于不同pH的PDA培養基上，設置5個處理，pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每處理5次重復。在室溫下培養，按1.2.6中的方法測量菌絲生長和產孢量。

2 結果與分析

2.1 美洲南瓜枯萎病田間發病癥狀

美洲南瓜枯萎病初期表現為植株下層葉片下垂或萎蔫，葉片顏色稍有加深，向主葉脈輕微皺縮，似缺水狀（圖1-b），病株莖基部維管束、莖稈表皮變褐腐爛（圖1-c～d），出現初期癥狀后3～4 d植株死亡。

2.2 美洲南瓜枯萎病病原菌的分離鑒定

2.2.1 病原菌的分離 在PDA培養基上對20株美洲南瓜病株全部進行分離與純化，共得到16種分離物，根據形態學特征歸為Ng-6、Ng-7 和Ng-8三個不同的類群，其中Ng-6包含3個分離物，占總分離物的18.75%;Ng-7包含11個分離物，占總分離物的68.75%;Ng-8包含2個分離物，占總分離物的12.5%。分別選取三個類群中最具代表性的Ng-6-1、Ng-7-1和Ng-8-1用于后續試驗。

2.2.2 致病性測定 從2.2.1分離得到的 Ng-6-1、Ng-7-1和Ng-8-1進行純化，分別用純化后的菌株回接到美洲南瓜相同品種健康幼苗（圖2），其中Ng-7-1的處理組美洲南瓜在7 d后發病且表現為葉片和莖稈萎蔫、失水，莖基部變褐，對照組均未發病且根系發達。根據柯赫氏法則，對接種病原菌后發病植株的病健交界處再次進行組織分離和純化，得到的病原菌與Ng-7-1一致，故初次分離到的Ng-7-1為美洲南瓜枯萎病的致病菌。

2.2.3 病原菌的形態學鑒定 將純化后的Ng-7-1菌株在PDA培養基上進行培養，在培養5～7 d 后可形成邊緣較整齊的圓形單菌落。菌落正面為白色或紫色，突起絮狀、絨毛狀，菌絲體纖細，背面產生紫色色素（圖3-a～b）;在CLA培養基上進行培養15 d后觀察到病原菌菌株的分生孢子有兩種形態，小型分生孢子數量居多呈橢圓形、卵形，多為單孢，大小為：（5.5～15.0×3.0～6.8） ?m（圖3-c） ;大型分生孢子數量較少呈鐮刀形，中間略彎曲，兩端細胞稍尖，多數為3隔，大小為：（17.8～35.5×4.0～5.8）?m（圖3-c）。根據菌落特征及病原菌分生孢子的形狀，初步鑒定分離純化的美洲南瓜枯萎病的病原為尖孢鐮孢菌F. oxysporum。

2.2.4 分子生物學鑒定 將Ng-7-1菌株的ITS序列的測序結果提交至GenBank，獲得注冊號為MN814027。通過與NCBI網站的數據庫進行比對分析，結果顯示該序列與尖孢鐮孢菌F. oxysporum的相似性達到了99%。建立系統發育樹（圖4），結果表明，Ng-7-1菌株與尖孢鐮孢菌聚在同一分支，親緣關系最近，從而確定從甘肅省武威地區采集的美洲南瓜枯萎病病株的病原菌為尖孢鐮孢菌F. oxysporum。

2.3 溫度對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響

不同的溫度對美洲南瓜枯萎病菌的菌株生長和產孢量具有一定的影響（表1），菌株在10～35 ℃范圍內均能生長產孢，在20～30 ℃的溫度范圍內菌絲生長較好，其中生長最快，產孢量也最多的溫度為25 ℃，該菌在溫度低于5 ℃或高于40 ℃的條件下不生長也不產生分生孢子。

2.4 光照對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響

該菌在25 ℃條件培養24 h后進行不同光照處理后，菌絲生長和產孢量呈現出一定的差異（表2）。其中12 h光暗交替培養96 h的菌絲生長速率最快，產孢量最多，持續黑暗菌絲生長速率最慢。持續光照產孢量最少。

2.5 不同碳源對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響

該病原菌在不同的碳源培養基上均能生長，并且都與對照差異顯著（表3）。其中最適碳源為淀粉，病原菌生長速率最快，產孢量最多，而該菌在葡萄糖培養基上生長速率最慢且產孢量最少。在對照培養基上菌絲幾乎不生長。

2.6 不同氮源對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響

該病原菌在不同的氮源培養基上均能生長產孢，但不同氮源之間存在一定的差異（表4）。其中在硝酸鈉和尿素培養基上菌絲生長速率較快且無顯著性差異，在硫酸銨培養基上菌絲生長最慢。在牛肉浸膏培養基上產孢量最多，與其他氮源差異顯著。在硫酸銨、尿素和硝酸銨培養基上產孢量較少且無明顯差異。缺氮時菌絲生長較快但只是稀疏的氣生菌絲，幾乎不產孢。

2.7 pH對美洲南瓜枯萎病菌生長和產孢量的影響

該病原菌在pH為5.0～9.0范圍內均能生長產孢（表5），其中pH為8.0時菌絲生長最快產孢量最多，而pH為5.0時菌絲生長速率最慢產孢量最少，說明該菌在中性及偏堿性條件下生長快，容易產孢。

3 討 論

研究表明，瓜類、香蕉、茄子、向日葵等植物的枯萎病均由尖孢鐮孢菌侵染所致[15-16]，該病菌具有不同的?；蚚17]。據報道，引起瓜類枯萎病的致病菌至少存在8個?；蚚18]，筆者對采集到的甘肅省武威地區美洲南瓜枯萎病進行病原菌的分離、純化和鑒定，結合菌落形態特征、顯微特征及ITS 分子鑒定結果對病原菌進行鑒定，確定引起甘肅省武威地區美洲南瓜枯萎病的病原為尖孢鐮孢菌F. oxysporum。

病原菌的生物學特性研究是病原菌的基礎研究，尤其為抗病育種和生物防治研究提供理論依據，本研究結果表明該菌在10～35 ℃范圍內均能生長產孢，25 ℃為最適生長溫度。菌絲生長最佳的光照條件為12 h光暗交替，最適碳源為淀粉。這與沈文淵[19]報道的尖孢鐮孢菌黃瓜?；?、尖孢鐮孢菌冬瓜?；?、尖孢鐮孢菌西瓜?；?、尖孢鐮孢菌苦瓜?；偷淖钸m溫度，光照和碳源的研究結果相似。根據肖昌華等[20]的報道，苦瓜枯萎病病原菌的生長最適pH為6.3，產孢最適pH為6.3～8.5，而本試驗中病原菌菌絲生長及產孢最適pH為8，分析原因可能是因為不同的?；途鷮ιL所需的酸堿度不同以及病原菌分離地的土壤酸堿度有關，但在總體上來看尖孢鐮孢菌適合在中性及偏堿性條件下生長。在沈文淵[19]的報道中4種尖孢鐮孢菌?；偷淖钸m氮源都為蛋白胨，而本試驗中病原菌生產速率最好的氮源為硝酸鈉和尿素，產孢量最多的是牛肉浸膏。分析原因可能是因為不同?；途g存在著對氮源的利用有一定的差異。同時說明該菌在菌絲的生長和產孢過程中不同的氮源起著不同的作用。

筆者鑒定了甘肅省武威地區美洲南瓜枯萎病的病原菌為尖孢鐮孢菌F. oxysporum，并對其生物學特性進行了測定，但美洲南瓜枯萎病病原菌是否存在?；?，以及該病原菌的傳播途徑等問題有待于進一步研究。

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