水稻GLW7基因功能標記的開發和基因效應分析

梁文化 孫旭超 陳濤 岳紅亮 田錚 趙凌 趙慶勇 趙春芳 朱鎮 張亞東 王才林

摘要：根據水稻粒長和粒質量調控基因GLW7已知功能位點的核苷酸差異設計分子標記，并對國內外搜集的315份秈、粳稻品種資源進行基因型檢測，分析其不同基因型的分布。同時，通過粒型性狀的測定，分析該基因的遺傳效應，評估其育種利用價值。結果表明，設計的功能標記能準確、有效地區分出201 bp和190 bp 2種帶型，即大粒（Large grain haplotype，LGH）和小粒（Small grain haplotype，SGH）2種等位變異。從秈、粳亞種間的基因型分布來看，秈亞種中LGH和SGH的比例分別為95.65%和4.35%，而粳亞種中LGH和SGH比例分別為25.50%和74.50%，2種等位變異的分布在秈粳亞種間存在明顯差異。粒型的測定結果表明，含不同等位變異的品種在粒長、粒厚、長寬比和千粒質量上存在顯著或極顯著差異，而粒寬則沒有明顯差異。進一步通過秈、粳分類分析發現，亞種間2種等位變異對粒型的效應并不完全一致，但都具有提高籽粒質量的作用。

關鍵詞：水稻;粒型;GLW7基因;功能分子標記

中圖分類號：S511.032文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0257-08

Abstract： In this study， molecular markers were designed according to the nucleotide differences of functional loci of GLW7 gene regulating rice grain length and grain weight. Genotypes of 315 indica and japonica varieties collected at home and abroad were detected， and the distribution of different genotypes was analyzed. Simultaneously， the genetic effects of the gene were analyzed， and its breeding value was evaluated by the determination of grain shape traits. The results showed that the designed functional markers could accurately and effectively distinguish 201 bp and 190 bp bands， which was corresponding to large grain haplotype （LGH） and small grain haplotype （SGH）， respectively. According to the genotype distribution between indica and japonica subspecies， the proportion of LGH and SGH in indica subspecies was 95.65% and 4.35%， while that was 25.50% and 74.50% in japonica subspecies， respectively. It was indicated that there was a significant difference in genotype distribution between two rice subspecies. The results of the grain size measurement showed that there were significant or extremely significant differences in grain length， grain thickness， length-width ratio and thousand grain weight among varieties with different allele variations， but there was no significant difference in grain width. Further analysis showed that the genetic effects of two allelic variations on grain shape were not identical between indica and japonica varieties， but the two allelic variations could increase grain weight.

Key words：rice;grain shape;GLW7 gene;functional molecular marker

水稻粒型包括粒長、粒寬和粒厚3個基本要素，是影響產量和品質的重要農藝性狀[1-2]，因此粒型基因的發掘和利用備受重視。目前水稻中已經定位了400多個與粒型相關的QTL，克隆的粒型基因已經超過60個，其中控制粒長的主要基因有GS3、GL3.1/qGL3、GLW7、OsLG3、TGW3、OsMADS1和GS9等[3-12]，控制粒寬的基因有GW2、GW5/qSW5、GS5、GW7和GW8等[13-18]，控制粒厚的基因有WTG1[19-20]。從對粒型的效應看，GS3、qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS9等基因對粒型具有負調控效應，而GS5、GW8、GW7、GLW7、OsLG3、OsMADS1等基因則對粒型具有正調控作用。大量的研究結果證實，通過調節籽粒性狀可以增加千粒質量，從而提高水稻產量。

GLW7基因編碼植物特異性轉錄因子OsSPL13，具有SPL家族特有的保守結構，能調節多個重要的生物學進程[8]。GLW7基因正調控粒長、粒厚和粒質量，而對粒寬沒有明顯的影響。在OsSPL13位點5′-UTR區域的一個6 bp的串聯重復序列CACTTC重復次數的變化是影響該基因轉錄與表達的關鍵。Si等[8]通過對47個熱帶粳稻品種OsSPL13位點的測序分析，發現該位點可分為2種不同的變異類型，即6個bp的CACTTC序列重復1次和2次兩種類型，而對部分秈稻品種進行分析只檢測到該序列重復1次的等位型。進一步研究發現大粒水稻的OsSPL13位點6 bp序列重復1次，而小粒水稻品種該序列重復2次，根據兩種基因型對應的籽粒形態特征，分別用大粒型（LGH）和小粒型（SGH）表示。通過對基因堿基序列的進化分析和1 040個水稻品種7號染色體遺傳差異的研究，推測熱帶粳稻中大粒等位型是秈稻品種漸滲而來的。通過對野生型和突變體的種子外稃長軸方向上細胞數目和大小分析，發現GLW7是通過增加細胞體積而使籽粒變大的。進一步研究證實GLW7能夠與DEP1基因互作，同時對穗長、一次枝梗數目和二次枝梗數目產生顯著影響[8]。因此，GLW7基因可以顯著改善籽粒大小和穗粒結構，在水稻育種中具有重要的利用價值。

分子標記輔助選擇是作物育種中利用優異基因的有效手段[21]，通過開發粒型基因分子標記能夠準確、高效地鑒定調控作物籽粒大小的有利等位變異[22-25]。為加快GLW7基因有利等位變異在水稻育種中的利用，本研究根據GLW7基因已知功能位點的核苷酸差異設計分子標記，并對國內外搜集的315份秈、粳稻品種資源進行基因型檢測，分析其不同基因型的分布，同時，通過粒型性狀的測定，分析該基因的遺傳效應，評估其在育種中的利用價值。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為江蘇省種質資源保護與利用平臺保存的315份國內外秈、粳稻品種，其中秈稻115份，粳稻200份（表1）。上述材料于2017年種植于江蘇省農業科學院試驗田，5月10日播種，6月10日移栽，每個品種種植4行，每行10株，株距為13.5 cm，行距為16.5 cm，常規栽培和管理。

1.2水稻成熟種子粒型相關性狀數據的測定

成熟后，每個品種按單株收取5個植株的種子。每個單株隨機挑選10粒飽滿種子使用游標卡尺（精度0.01 mm）測量粒長、粒寬和粒厚，用電子天平（精度0.001 g）測定單株1 000粒風干種子的質量（千粒質量）。每個性狀以5株的平均值為最終的表型值。

1.3GLW7基因功能標記開發和引物合成

根據Si等[8]的報道，從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載到小粒品種Dongjing（DJ）和大粒品種GP7 GLW7的基因組序列LT159866.1和LT159955.1。通過多序列比對分析，選取變異位點上、下游200 bp的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0 軟件對GLW7基因5′端非翻譯區（Untranslated region，UTR）中-146～-135 bp區域CCATTC串聯重復的變異位點設計引物，并由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.4DNA提取、PCR擴增和電泳檢測

在水稻分蘗盛期，取新鮮幼嫩的葉片，采用CTAB法提取水稻基因組DNA[26]，并進行PCR擴增。10 μl的PCR反應總體系包含：ddH2O 7.2 μl，模板DNA（20 ng/μl）1.0 μl，10×Buffer（25.0 mmol/L）1.0 μl，dNTP（2.5 mmol/L）0.2 μl，正、反向引物（10 μmol/L）0.4 μl，Taq DNA聚合酶（2 U/μl）0.2 μl。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，57 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸7 min，4 ℃保持2 min。引物擴增產物在9%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，銀染后在膠片觀察燈上拍照、統計。

1.5數據分析

利用Excel（2016）和SPSS（22.0）軟件進行粒型相關數據分析。

2結果與分析

2.1GLW7基因的堿基序列分析及功能標記開發

從NCBI網站下載小粒品種Dongjing（DJ）和大粒品種GP7的基因組序列LT159866.1（5 864 bp）和LT159955.1（5 840 bp）進行序列比對分析。結果表明，GLW7基因在大粒品種中5′-UTR區域-146～-135 bp CACTTC重復1次，而在小粒品種中重復2次，這與已報道的結果完全一致，而該短序列串聯重復次數差異是影響GLW7基因表達水平和籽粒大小的關鍵。5′-UTR區域的6 bp短序列重復1次，GLW7基因表達水平升高，正調控穎殼細胞體積而使籽粒變大;而該短序列重復2次則降低了基因的表達水平，使籽粒變小[8]。在其轉錄起始位點（ATG）上游5′-UTR區域串聯重復序列變異的位點附近分別設計上游引物GLW7-F 5′-TATCCCTTTCAACCTTTTCCA-3′和下游引物GLW7-R 5′-GACGACGAGCTAGTGCTACTGT-3′。序列比對發現在功能位點附近大粒品種GP7還存在5 bp的缺失，因而最終PCR擴增產物的差異是由兩個鄰近位置的插入缺失（InDel）造成的，因而小粒品種Dongjing（DJ）能擴增出201 bp的條帶，而大粒品種GP7則能擴增出190 bp的條帶（圖1）。

2.2GLW7基因功能標記驗證

為驗證功能標記GLW7-F/GLW7-R在水稻品種中是否能進行有效擴增并區分GLW7基因的不同等位變異，從315份水稻資源中隨機選取秈、粳稻品種各40個進行PCR擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。結果顯示每個品種都能擴增出單一、清晰的條帶，沒有非特異性擴增和拖尾現象，說明本研究設計的引物特異性較好，擴增效率高。從帶型來看，所有秈、粳稻品種都能擴增出與大、小粒品種GP7和Dongjing（DJ）同樣的190 bp或201 bp 2種類型的條型，分別代表GLW7基因功能變異區域6 bp短序列重復1次和2次的結果（圖2、圖3）。這表明，該功能標記能夠準確、有效地區分秈、粳稻品種中GLW7基因2種等位變異。

2.3GLW7基因功能標記對不同水稻品種的基因型鑒定

為明確GLW7基因在秈、粳稻品種中的基因型分布以及對粒型的效應。利用功能標記GLW7-F/GLW7-R繼續對所有的115份秈稻和200份粳稻資源進行基因型檢測。結果顯示大?；蛐秃托×；蛐偷钠贩N數分別為161份和154份;115份秈稻品種中大?；蛐?10份（95.65%），而200份粳稻品種中大?；蛐蛢H為51份（25.50%）。由此可見GLW7基因等位變異在秈稻和粳稻中的分布存在明顯差異（表1）。

為分析GLW7基因不同等位變異對粒型的影響，我們在2017年對315份水稻品種資源進行粒型相關性狀的測定。結果顯示，含GLW7大粒等位變異的品種在粒長、粒厚、長寬比和千粒質量上極顯著高于小粒等位變異的品種，而粒寬卻極顯著低于小粒等位變異的品種（表2）。

由于基因GLW7大粒型等位變異在秈、粳稻中的分布存在明顯差異，為進一步明確GLW7基因不同等位變異在水稻亞種中的效應，在秈、粳分類的基礎上根據對基因型的檢測結果進行分析。結果顯示，在秈稻中，含GLW7大粒等位變異的品種粒長、長寬比、千粒質量極顯著高于小粒等位變異品種，其粒長平均增加11.79%，千粒質量平均增加7.96%，但二者的粒寬和粒厚卻沒有顯著差異（表3）。而在粳稻品種中，兩種基因型品種的粒長和千粒質量存在極顯著差異，在粒厚上存在顯著差異，但粒寬卻沒有顯著差異，含GLW7大粒等位變異的粳稻品種粒長和千粒質量分別比小粒等位變異的粳稻品種增加2.23%和4.32%（表4）。這也證實了GLW7基因的大粒型等位變異確實對增加粒長、提高千粒質量具有重要的作用。

3討論

表型選擇是傳統育種的主要方法，而基因型、環境以及它們之間的互作等因素往往影響了育種家對表型的判斷，因而傳統育種不僅準確性差，而且周期較長。分子標記輔助選擇可以提高育種的效率和準確率，在品種選育中具有重要作用[27-29]。本研究基于基因GLW7功能位點的序列差異設計了特異性引物，并對315份來自國內外水稻品種進行基因型檢測，發現該位點只有2種等位變異類型，設計的功能標記GLW7-F/GLW7-R能夠準確、高效地區分不同品種等位變異。對115份秈稻和200份粳稻的基因型檢測結果表明，GLW7基因大粒等位變異在秈稻中占95.65%，而在粳稻中僅占25.50%，說明該基因的等位變異在亞種中分布存在明顯的差異。粳稻中大粒型的等位基因頻率較低，這可能與不同地區對粳稻粒型的選擇性有關，也可能與本研究中所用的粳稻材料多為圓粒型，而長粒型粳稻相對偏少有關。

粒型是水稻產量的重要構成因素，籽粒的大小和形狀決定了水稻經濟產量的潛力，對提高千粒質量有著重要的影響。對GLW7基因T-DNA插入突變研究結果表明，突變體的粒長，粒厚和粒質量均顯著降低[8]。通過對315份水稻資源進行粒型性狀的測定分析，發現GLW7基因2種等位型的品種在粒長、粒厚及千粒質量上均有極顯著的差異?；蛐蜑樾×Ｐ秃痛罅Ｐ偷钠贩N粒寬平均值分別為3.38 mm和2.98 mm，前者明顯大于后者，進一步分析結果表明出現這種現象的根本原因是粳稻和秈稻之間的差異造成的。為深入研究GLW7基因對粒型的作用效應，將315個水稻品種按秈、粳分為2組分別進行分析。結果顯示，秈稻中具有大粒等位變異的品種粒長和千粒質量顯著增加，而粒寬和粒厚沒有明顯差異;粳稻中2種等位變異的品種粒長和千粒質量差異極顯著，粒厚差異顯著，粒寬差異不顯著。這與之前報道的結果[8]一致。綜上所述，GLW7基因在秈稻和粳稻中對粒型不同性狀的效應并不完全一樣，這可能是由秈稻和粳稻中不同遺傳背景差異造成的，也可能與粳稻中其他粒型基因的相互作用相關。

利用分子標記輔助選擇進行優異基因的聚合是水稻育種的趨勢[30-31]。在粒型方面， GS3、GW8和GW7基因的聚合，能有效改良水稻的粒型，同時產量和品質也得到顯著提高[17-18，32-33]。研究結果證明GLW7基因與GS3基因對籽粒的調控是獨立的通路[8]，推測聚合這2個基因可能對粒型改良有明顯的作用，因而GLW7基因在粒型基因聚合育種中具有較大的潛力。本研究開發的功能標記可以有效地區分GLW7不同的等位變異，為該基因在育種中的利用奠定了基礎。

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（責任編輯：張震林）