過表達番茄LeDnaJ基因提高陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.） R15的耐鹽性

聞甜 陳祥龍 武曉剛 權永剛 徐鵬 郭琪 倪萬潮 陳愛民

摘要：DnaJ蛋白不僅在生物體應對熱激脅迫方面起作用，而且能響應鹽、重金屬和氧化等多種脅迫，因此，DnaJ蛋白的相關研究對植物抗逆研究具有重要意義。在前期的研究中，筆者所在課題組已經利用電子克隆及逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）的方法從番茄中克隆了全長為465 bp的熱激蛋白基因LeDnaJ。為了進一步驗證其功能，針對LeDnaJ基因構建了含有35S啟動子及NOS終止子的植物表達載體，通過農桿菌介導法轉化到陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）品系R15中。目的基因的PCR檢測結果表明，LeDnaJ基因已經整合到陸地棉R15基因組中;耐鹽性鑒定結果表明，LeDnaJ基因的表達，提高了陸地棉R15萌發期、苗期的耐鹽性。該研究結果為棉花耐鹽性的改良提供了新的基因資源。

關鍵詞：陸地棉;LeDnaJ基因;過表達;耐鹽性

中圖分類號：S332.6文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0271-06

Abstract：DnaJ protein not only plays a role in the response of organisms to heat shock stress， but also responds to various stresses such as salt， heavy metals and oxidation， so the related researches are of great significance to stress resistance investigations in plants. The heat shock protein gene LeDnaJ with a whole length of 465 bp was cloned from tomato by the methods of electronic cloning and reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） in the previous studies. In order to verify the functions of LeDnaJ gene， the plant expression vector containing LeDnaJ gene with NOS terminator and 35S promoter was constructed and transformed into Gossypium hirsutum Linn. R15 by Agrobacterium-mediated method. The PCR detection result of the target gene showed that the LeDnaJ gene had been integrated into the cotton genome. The results of salt tolerance identification indicated that the expression of LeDnaJ gene improved the salt tolerance of Gossypium hirsutum Linn. R15 ?at germination and seedling stages. These results provide new genetic resources for the improvement of salt tolerance in cotton.

Key words：Gossypium hirsutum Linn.;LeDnaJ gene;overexpression;salt tolerance

DnaJ蛋白是首次從大腸桿菌中分離出來的一種41 000大小的熱激蛋白（Heat shock protein， HSP），又名HSP40[1]。熱激蛋白是植物為了適應不斷變化的逆境脅迫而誘導自身產生的一種具有抵御作用蛋白質。作為HSP70蛋白的輔助伴侶蛋白，DnaJ蛋白由腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）為HSP70蛋白供能，并引導蛋白質的正確組裝和折疊。HSP70蛋白本身并不直接參與新生多肽底物的結合，其功能的行使必須依賴能與其特異性結合的DnaJ蛋白。DnaJ蛋白結構復雜，在通常情況下含有3個保守的結構域，分別是位于N端的核心結構為組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸三肽的J結構域、富含甘氨酸（G）和苯丙氨酸（F）的G/F結構域和含有4個Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly（Cys為半胱氨酸，Gly為甘氨酸，X為任意氨基酸）基序的鋅指結構域[2]。根據結構域的種類，DnaJ蛋白家族成員可以分為以下3類：第1類，同時含有J結構域、G/F結構域及鋅指結構域;第2類，含有J結構域及G/F結構域或鋅指結構域中的1個;第3類，只含有J結構域[3]。以上3類蛋白家族成員都具有與HSP70蛋白直接作用的J結構域。

DnaJ蛋白在響應許多生物及非生物脅迫的過程中起著重要作用。植物中的DnaJ可以響應很多誘導因素，如重金屬、高溫、冷害、干旱、鹽堿及病原菌等。另外，DnaJ蛋白基因的表達有組織特異性，并受生物發育階段的調節。盡管目前人們已經從擬南芥[4]、報春花[5]、苜蓿[6]等植物中獲得了DnaJ蛋白，但是關于植物中DnaJ蛋白的研究仍遠遠滯后于人類、動物及細菌中DnaJ蛋白的相關研究。在前期的研究中，筆者電子克隆了番茄LeDnaJ基因的全長。為了進一步驗證其功能，筆者構建了含有35S啟動子及NOS終止子的植物表達載體，通過農桿菌介導法將LeDnaJ基因轉化到陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）品系R15中，經過目的基因的PCR檢測，獲得陽性轉LeDnaJ基因棉花株系，進一步分析該基因在鹽脅迫下的功能，從而為棉花耐鹽性的改良提供新的基因資源。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究的供試番茄材料為Moneymaker，由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供;轉基因棉花受體材料為陸地棉R15，是由晉棉7號多代再生選育出的胚胎發生純合系，由山西省農業科學院棉花研究所提供。采用天根生化科技（北京）有限公司的試劑盒提取番茄總RNA，再用DNA酶去除其中的gDNA，然后用M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）反轉錄酶反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.2植物表達載體的構建

在LeDnaJ基因的上、下游設計1對帶有BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ 酶切位點的特異引物（LeDnaJ-F-BamH Ⅰ：5′-CGGGATCCATGGCTTCTTCTTCTTTTCTTCTCTC-3′;LeDnaJ-R-Kpn Ⅰ：5′-GGGGTACCCTACCAACACTGATCGGTTTCCCATC-3′，引物中的下劃線表示酶切位點），將逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）產物連接到經BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ 雙酶切處理的pCAMBIA2301載體上，構建pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ植物表達載體。用熱激法將PCR和酶切鑒定驗證正確的重組質粒轉入農桿菌菌株EHA105感受態細胞中，獲得工程農桿菌EHA105用于下一步的遺傳轉化。

1.3農桿菌介導的棉花遺傳轉化及陽性植株的鑒定

通過農桿菌介導的遺傳轉化方法[7]將pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ轉化到受體棉花R15中。用特異性引物LeDnaJ-F和LeDnaJ-R進行PCR擴增，以篩選陽性植株。進一步提取PCR檢測結果呈陽性植株的RNA，以反轉錄生成的cDNA為模板，以LeDnaJ-RT-F（5′-CTCTACAATCGCCTCACATACA-3′）、LeDnaJ-RT-R（5′-TTCCCATCCTCGGCGAACAGTA-3′）為引物進行RT-PCR擴增，分析目的基因的表達水平。

1.4萌發期和苗期棉花耐鹽性表型的鑒定

先用體積分數為30%的H2O2對棉花種子消毒2～3 h，再用ddH2O清洗3～5次。萌發期發芽率的測定方法：將棉花種子置于含有200 mmol/L NaCl的玻璃培養皿中，重復3次，每個重復設50粒種子，以蒸餾水處理作為空白對照（CK），將玻璃培養皿置于溫度為（30±1） ℃、相對濕度為80%±2%的無光照環境中進行催芽，以種子露白部分超過5 mm視為種子發芽，7 d后統計種子的發芽數量。計算公式：種子萌發率=露白部分超過5 mm的種子數/種子總數×100%。萌發期根長的測定：將棉花種子置于含有200 mmol/L NaCl的固體MS培養基上進行培養，每個材料設3個重復，每個重復設50粒種子，種子發芽（露白部分>5 mm）后，測量種子的根系長度（cm）。

將預先發芽的轉基因株系及其對照R15種子播于一次性紙杯中，置于溫度為28 ℃、光照時間為16 h/d的房間內進行培養。待植株長至2葉1心期時開始進行鹽處理，分別用350 mmol/L NaCl和清水各處理10株幼苗，同時，另取生長一致的10株幼苗，測量處理前植株的株高、地上部鮮質量和地上部干質量等。處理30 d后分別測定350 mmol/L NaCl和清水處理植株的株高、地上部鮮質量、地上部干質量等。分別計算鹽脅迫、清水處理植株培養30 d的生長量，以植株在清水中的生長量作為對照，計算植株在鹽脅迫下的相對生長量，評價其耐鹽性。

1.5數據分析方法

用t檢驗測試組間平均值的差異，分析轉基因材料與非轉基因對照之間的表型是否存在差異。

2結果與分析

2.1LeDnaJ基因序列分析

在前期的研究中，筆者電子克隆了番茄的LeDnaJ基因，該基因序列全長465 bp，GenBank登錄號為EF208898.1。利用DNAStar等軟件分析得出，該基因編碼的蛋白質含有155個氨基酸，相對分子質量為17 030，理論等電點為10.49。通過美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.Cgi）對蛋白質保守結構域進行分析，結果表明，LeDnaJ基因編碼的蛋白質僅在N端含有1個高度保守的長約70個氨基酸的J-結構域，屬于僅含有1個J結構域的第3類DnaJ-like蛋白家族成員。

2.2轉LeDnaJ基因棉花的鑒定結果

分別用KpnⅠ、BamHⅠ對LeDnaJ目的片段和載體質粒pCAMBIA2301-CaMV35S進行雙酶切，然后連接、轉化，用引物LeDnaJ-F、LeDnaJ-R對轉化后得到的重組質粒pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ進行PCR擴增，得到465 bp大小的片段，與預期大小一致。經酶切鑒定及測序驗證正確后，篩選出構建成功的植物表達載體pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ。通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，將pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ轉化到受體棉花材料R15中，經過植物組織培養，得到T0代植株。將T0代轉基因種子通過種植進行加代，提取T1代植株葉片的DNA，并進行PCR檢測，獲得8株pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ陽性單株（圖1）。

為了進一步驗證LeDnaJ基因整合到陸地棉基因組中后的表達情況，筆者從獲得的8株陽性單株中選擇3株提取RNA并將RNA反轉錄為cDNA進行RT-PCR驗證。如圖2所示，RT-PCR鑒定結果驗證了3株陽性單株中的LeDnaJ基因均能夠正常表達。

2.3轉LeDnaJ基因棉花株系萌發期的耐鹽性

在前期進行同源比對后發現，LeDnaJ基因與AT2G17880基因同源，后者編碼DNA J protein C24。Sottosanto等研究發現，AT2G17880基因受到鹽脅迫的誘導[8]。因此，本研究從表型上對轉LeDnaJ基因棉花株系后代在萌發期、苗期的耐鹽性進行鑒定。經過連續自交，獲得3個T5代轉LeDnaJ基因棉花純系后代，分別挑選3個轉LeDnaJ基因棉花株系、受體材料R15（對照）50粒飽滿的種子用于萌發期發芽率的測定。在第7 d統計棉花種子的發芽數量，從表1可以看出，鹽脅迫下3個轉基因棉花株系的相對發芽率均顯著高于對照，因此認為，LeDnaJ基因的表達提高了棉花R15種子在鹽脅迫下的發芽率。

本研究同時測量了3個轉基因棉花株系及其受體材料R15（對照）在鹽脅迫下萌發期的根長。由圖3可見，在含有200 mmol/L NaCl的MS培養基上催芽3 d后，對照的根系伸長受到了明顯抑制，而3個轉基因棉花株系的根系伸長相對正常，均明顯高于對照。將鹽脅迫下的棉花根長與清水處理的棉花根長的比值作為相對根長，由表2可知，D-1、D-2、D-3這3個轉基因株系的相對根長均極顯著高于對照，說明LeDnaJ基因的表達提高了陸地棉R15萌發期的耐鹽性。

2.4轉LeDnaJ基因棉花株系苗期的耐鹽性

待3個轉LeDnaJ基因棉花植株長至2葉1心期時，分別用350 mmol/L NaCl和清水處理植株，30 d后測定鹽脅迫、清水處理植株的相關表型指標，從而鑒定轉基因棉花株系苗期的耐鹽性。由圖4可見，處理30 d后鹽脅迫下轉基因棉花株系的株高明顯高于其受體材料R15（對照）。表3顯示，3個轉基因棉花株系的相對株高、地上部分相對鮮質量和地上部分相對干質量均顯著或極顯著高于受體材料R15（對照），表明LeDnaJ基因的表達提高了陸地棉R15苗期的耐鹽性。

3討論

近期的研究發現，DnaJ蛋白作為一種廣泛存在于植物細胞內的分子伴侶參與了多種植物抵抗非生物脅迫的過程。張大棟等[9]通過抑制消減雜交方法，從鹽生植物海蓬子中克隆了DnaJ-like基因，Northern雜交結果顯示，在200 mmol/L NaCl脅迫下，該基因的表達量顯著增多。趙志常等[10]通過RT-PCR技術從野生型擬南芥中克隆了DnaJ基因，并構建了含有目的基因的pET32a原核表達載體，在細菌中過量表達DnaJ基因后發現，其在含有0.5 mol/L NaCl的培養基中仍然可以正常生長，推測DnaJ基因的過表達提高了細菌的耐鹽性。擬南芥中的BIL2基因是定位在線粒體上的DnaJ基因家族成員[11]，過表達BIL2基因能增強擬南芥植株對鹽和強光脅迫的耐受性[12]。Fu等[13]研究發現，ER-sHSP基因能夠提高番茄的耐鹽能力，在鹽脅迫下，轉ER-sHSP番茄植株通過更粗壯的根來維持其體內相對較高的含水量，同時也能夠吸收少量的Na+，積累更多的滲透物質和Ca2+，以減少鹽脅迫對光系統的傷害。Sun等[14]研究發現，AsHSP17能夠被高溫、鹽脅迫或脫落酸（ABA）處理所誘導。過表達AsHSP17基因會提高匍匐剪股穎（Agrostis stolonifera）對外源脫落酸和鹽的超敏性，在這一過程中AsHSP17蛋白作為分子伴侶負調控光合作用和脫落酸依賴/獨立的信號通路，提高了匍匐剪股穎對不良環境的抗性。

本研究從番茄中克隆了熱激蛋白基因LeDnaJ，并通過轉基因棉花株系驗證了其耐鹽功能，發現LeDnaJ基因顯著提高了陸地棉的耐鹽性。目前，關于陸地棉中已克隆的熱激蛋白基因的研究仍然較少。Kosmas等[15]從陸地棉中克隆了HSPCB基因，RT-PCR結果顯示，該基因的表達受到干旱脅迫的誘導。Maqbool等[16]從受干旱脅迫的亞洲棉中克隆了GHSP26基因，發現在干旱脅迫后的亞洲棉脫水葉片組織中GHSP26基因顯著表達，過量表達GHSP26基因提高了陸地棉對干旱和熱脅迫的耐受性[17-18]。此外，Wang等[19]應用表達序列標簽（Expressed sequence tag，EST）組裝法和全基因組鑒定技術克隆了40個GhHsf基因，對植物不同發育階段、不同組織中基因表達譜的分析結果表明，GhHsfs基因在棉花響應非生物脅迫耐受性和纖維發育等方面發揮重要作用。近年來，越來越多的非生物脅迫嚴重影響棉花的生長發育過程，導致其產量減少和纖維品質下降。其中鹽害和干旱對于棉花產量潛力發揮的影響最嚴重。DnaJ蛋白家族成員作為脅迫響應因子將在棉花抵御干旱和鹽害脅迫中扮演重要的角色，進一步加強棉花DnaJ蛋白家族成員的研究將為棉花抗旱、抗鹽堿的遺傳改良提供更豐富的基因資源。

鑒于在響應逆境脅迫過程中的保護性角色，DnaJ蛋白在多種作物中已經受到廣泛的關注。通過分子遺傳學手段已經證實了DnaJ蛋白在多種逆境脅迫下起調節作用，并且在多種植物中過表達DnaJ基因可以改良植物抵抗逆境脅迫的能力。植物在面臨逆境脅迫時，能夠激活并表達DnaJ蛋白，保護正常蛋白質不被降解以維持植物自身正常的生長發育。然而，DnaJ蛋白如何抵抗逆境脅迫以發揮保護作用的具體機制還未被解析。因此，進一步加深DnaJ蛋白與其他蛋白質之間互作的研究將有助于解析其抵抗逆境脅迫的分子機制，從而為植物的抗逆育種提供依據。

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（責任編輯：徐艷）