同種異體牙囊細胞膜片在異種生物牙根再生中作用

韓雪 郭維華

本課題組前期已經成功利用同種異體的處理后牙本質基質(allogeneic treated dentin matrix，aTDM)作為生物支架復合同種異體牙囊細胞(allogeneic dental follicle cell, aDFCs)或牙囊細胞膜片(allogeneic dental follicle cell sheets, aDFCSs)構建同種異體的生物牙根，并在大小動物體成功再生出類似牙髓-牙本質復合體及牙周-牙本質復合體的結構[1-2]。豬來源的組織器官與人體組織器官具有相似的大小及物理化學結構，已被應用于修復多種組織/器官損傷或缺損，成功解決了同種異體器官來源短缺問題[3]。本課題組通過同種異體的細胞懸液接種至異種的處理后牙本質基質(xenogeneic treated dentin matrix，xTDM)支架的方式構建的異種生物牙根，在體內成功再生出類似于天然牙根的生物牙根復合體[4]。然而在異種支架植入后期出現了明顯的免疫炎癥反應，表現為生物支架的溶解、吸收、排出，導致植入失敗。

研究表明，異種脫細胞支架材料引起的免疫排斥反應主要表現為慢性炎癥[5]。移植物植入宿主后，來自血液和組織間液的蛋白質立即吸附到生物材料表面形成蛋白層，此層決定了凝血級聯反應、補體系統、血小板及免疫細胞激活并引導他們相互作用，標志炎癥反應的開始[6]。因此有研究將異種來源的移植物包裹于有隔離作用的膜內，實現免疫隔離，進而促進移植的成功[7]。隨著細胞膜片技術的成熟，將種子細胞以膜片的方式與支架材料復合更簡單有效，同時膜片含有相對較少的細胞及豐富的細胞外基質，其免疫源性進一步降低。因此本實驗擬運用aDFCSs復合xTDM構建異種生物牙根，以探究aDFCSs是否能夠降低免疫排斥反應促進異種生物牙根再生，以期進一步優化生物牙根的構建策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-型改良伊格爾培養基(α-MEM，Hyclone，美國)； 胎牛血清(FBS, Gibco，美國)； 雙抗溶液(Invitrogen，美國)； I型膠原酶(collagenase type I)、 L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)、 茜素紅、 EDTA(Sigma，美國)。

1.2 豬來源TDM的制備

選用12～15 月齡的小型豬的新鮮下頜切牙制備TDM。使用牙科用高速渦輪機去除牙冠及牙根表面覆蓋的牙周組織及牙骨質。使用拔髓針完整拔除牙髓組織，并用高速渦輪機磨除殘余牙髓組織及前期牙本質。進一步加工成長約 10 mm，直徑 3～5 mm 的標準形態用于體外實驗；長×寬為2 mm×2 mm方形的片段用于大鼠頜骨內移植。依據以往實驗方法，在含有不同濃度的乙二胺四乙酸(EDTA)中進行梯度脫礦，每個濃度梯度脫礦30 min制備成xTDM。

1.3 牙囊細胞的提取及多向分化檢測

人源性的DFCs來自因臨床原因拔除的第三阻生牙的牙囊組織，鼠源性的DFCs來自于出生2～3 d的乳鼠磨牙的牙囊組織。通過I型膠原酶提取牙囊組織中的牙囊細胞，并通過連續傳代純化。采用第3 代的DFCs用于后續實驗。通過茜素紅染色、油紅O染色及免疫熒光檢測神經細胞表面標記βШ-tubulin，檢測牙囊細胞的多向分化潛能。

1.4 牙囊膜片的培養

將生長狀態良好的第3 代牙囊細胞按2×105/孔接種至6 孔板內，待細胞密度達到70%時，更換成含有50 μg/ml抗壞血酸的細胞膜片培養基。每3 d更換培養基，連續培養直至形成肉眼可見的細胞膜片。

1.5 異種生物牙根的構建

將膜片剝離孔板底部，用鈍性眼科鑷將小心膜片均勻的包裹在1.2中制備好的TDM上，于正常培養基中培養用于體內或體外實驗。

1.6 生物牙根復合體中牙囊細胞活死細胞檢測

LIVE/DEAD Cell image Kit試劑盒來染色檢測生物牙根構建后及培養1 d后細胞膜片內細胞存活情況，于染色后2 h內于激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)下采集3D圖像。

1.7 實時熒光定量PCR

以 1×105個細胞/孔的細胞密度接種于6 孔板中，待細胞貼壁后加入TDM與人源性的DFCs共培養3 d，以未加入TDM牙囊細胞作為陰性對照組。提取mRNA并進行逆轉錄。以 GAPDH為內參，采用real-time PCR(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo Scientific，MA, USA)檢測IL-6及TGF-β免疫相關基因的表達。相關引物序列見表 1。

表 1 實時熒光定量PCR引物

1.8 異種生物牙根大鼠頜骨內移植

取10 周齡的SD大鼠8 只，隨機分成2 組，每組4 只大鼠。 實驗組植入異種生物根，對照組植入TDM。于下頜角至磨牙后區中間采用種植機預備直徑3 mm，深1 mm大小的植入洞型。分別植入異種生物牙根和TDM，嚴密縫合傷口，分別于1 周和4 周取材。通過HE和Masson染色觀察組織再生情況，通過Trap染色觀察免疫排斥情況。

1.9 數據統計及分析

2 結 果

2.1 牙囊細胞多向分化潛能

經茜素紅染色，鏡下可見鈣化結節樣結構(圖 1A)。成脂誘導誘導后經油紅O染色，胞漿內可見大小不等的脂滴分布(圖 1B)。成神經誘導培養后，分化后的DFCs陽性表達神經細胞表面標記βШ-tubulin(圖 1C)。以上結果說明，經過分離培養DFCs具有多向分化潛能。

2.2 生物牙根復合體中牙囊細胞活死細胞檢測

生物牙根復合后即刻活死細胞檢測結果顯示，僅于膜片邊緣檢測到少量紅色的死細胞(紅色)，機械損傷及環境突變均未對牙囊細胞活性造成顯著的影響。培養1 d后，膜片中牙囊細胞活性良好，異種生物材料對膜片中牙囊細胞無細胞毒性。

A: 茜素紅染色(×40)； B：油紅O染色(×200)； C：βⅢ-tubulin免疫熒光檢測(×400)

圖 2 牙囊細胞膜片活(綠色)死(紅色)細胞染色(×100)

Fig 2 Live (green)/ dead (red) cell staining of aDFCSs(×100)

2.3 牙囊細胞分化過程中免疫相關因子檢測

Real-time PCR結果顯示，與對照組相比，xTDM組牙囊細胞IL-6基因表達顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。TGF-β表達稍降低，差異具有統計學意義(P<0.01)(圖 3)。

圖 3 各組aDFCs細胞因子基因表達分析

2.4 異種生物牙根體內移植后TRAP陽性破骨細胞變化

植入1 周后，xTDM組可見大量的破骨細胞聚集在TDM表面及頜骨表面。生物牙根組TDM為纖維組織包繞，未見TRAP陽性破骨細胞。 植入4 周后，xTDM組生物支架吸收明顯，但TRAP陽性破骨細胞消失。生物牙根組部分TDM區域可見破骨細胞，并形成吸收陷窩。

2.5 異種生物牙根體內移植后組織再生

HE與Masson結果顯示植入4 周后，xTDM組骨質增生礦化明顯且處于礦化成熟階段。生物牙根組TDM周圍形成排列有序的纖維結構，并分離生物牙根與骨組織?？拷黅DM側的細胞成高柱狀，類似成牙本質細胞(圖 5)。

圖 4 大鼠頜骨內異種生物牙根移植后TRAP染色(×200)

Fig 4 TRAP staining of xenogeneic bio-root after implantation in rat mandible(×200)

圖 5 異種生物牙根移植后4 周組織學染色(×200)

Fig 5 Histologic staining of xenogeneic bio-root 4 weeks after implantation(×200)

3 討 論

隨著生物材料、干細胞生物學及臨床醫學的不斷發展，組織工程技術已發展成為解決可移植組織與器官的短缺的有效手段。異種生物支架因其材料來源豐富，經脫細胞處理后免疫源性大幅降低，已成為組織工程學界研究的熱點[8]。細胞膜片是由相對較少的細胞及較豐富的細胞外基質形成的內源性支架，具有多種蛋白和蛋白多糖[9]。與傳統組織工程中采用細胞懸液復合生物支架的方式相比，將種子細胞以膜片的方式與支架相復合的方式細胞浪費率更低、分布更均勻、操作簡單、接種效率高而越來越受到重視。本實驗嘗試將aDFCSs與豬來源的TDM相復合構建異種生物牙根，植入大鼠頜骨內觀察同種異體牙囊細胞膜片在異種生物牙根再生中的作用。

組織工程化生物牙根構建中，膜片技術能延長種子細胞的生存時間，并能夠釋放多種細胞因子以促進組織再生[10]。但是隨著膜片培養時間的延長，其中間部分的細胞會因營養不足而發生凋亡，同時復合支架的機械操作也對膜片中細胞造成損傷。凋亡細胞會激活機體免疫清除功能，導致組織損傷[11]。實驗結果表明培養3 周的細胞膜片內牙囊細胞活性良好，復合操作對牙囊細胞損傷較小。因此采用此方法構建生物牙根合理可行。

生物牙根植入體內4 周后，生物牙根周圍形成了排列有序的類牙周膜-牙本質的纖維結構。研究表明DFCSs表達多種成牙/成骨相關蛋白如DMP-1、COL-1、ALP、OCN等，有助于纖維組織及牙體組織再生[12]。牙囊細胞膜片結構致密，起到類似于牙周組織再生中GTR膜作用，分隔牙和骨從而降低粘連發生的機率，有利于牙周膜復合體的形成。

而未包裹牙囊細胞膜片的xTDM支架植入大鼠頜骨內后，靠近頰側以骨增生為主，靠近口腔側以吸收為主。破骨細胞早期識別脫細胞支架中殘留的損傷相關分子模式蛋白(DAMPs)，上調核心結合因子NF-κB的受體(RANKL)造成支架吸收[13]?；谄乒羌毎?成骨細胞平衡，于支架另一側形成新生骨[14]。

研究表明間充質干細胞不僅具有多向分化潛能而且能夠在組織再生中發揮免疫調控作用。例如：劉文靜等研究發現，在炎癥環境中，人顳下頜關節滑液間充質干細胞分泌的IL-6和IL-8明顯增加，并參與介導關節軟骨破壞[15]。Marusina等[16]研究發現間充質細胞IL-6的分泌減少有助于傷口的愈合。本研究中牙囊細胞與異種生物支架相互作用后，IL-6的分泌顯著減少，可能有利于生物牙根移植后的組織再生。經牙囊細胞膜片修飾后的xTDM對于機體免疫系統形成同種異體干細胞膜片植入物的假象，進而進一步降低免疫炎癥反應，促進組織修復進程。

綜上，同種異體牙囊細胞膜片異種生物牙根再生中不僅起到種子細胞的作用，同時作為屏障起到分隔組織發育區及阻擋免疫炎癥反應進程的作用。

doi:10.1002/adhm.