伴放線放線桿菌中幽門螺桿菌毒力相關基因的生物信息學分析

孫靜華 張琛 侯本祥

Sun等[1]對35例胃癌前病變患者以及70 例同年齡段健康者的口腔狀況進行評估時發現，胃癌前病變與牙周疾病有關，且胃癌前病變患者口腔中的菌群相對于健康者比較單一，表現為主要牙周致病菌有所增高?？梢娧乐懿ξ赴┑陌l生發展有一定的相關性，可能與口腔的菌群變化有關。

幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)，與慢性胃炎、十二指腸潰瘍和癌、胃潰瘍和癌的發生有關[2-4]，牙周病患者齦下菌斑中Hp的檢出率明顯高于健康人群[5]。細胞毒素相關基因(cytotoxinassociatedgeneA，cagA)是Hp最重要的毒力因子之一，位于Hp基因組中約40 kb的特殊DNA區域，該DNA片段被稱為細胞毒素相關蛋白A致病島(cag pathogenicity island，cagPAI)[6]。cagPAI包含多個基因，可編碼Ⅳ型分泌系統(Type Ⅳsecretion system，T4SS)的主要成分，包括cagE(cytotoxinassociatedgeneE)等，并與毒素裝配和分泌有關[7]。CagA蛋白可通過cagPAI編碼的T4SS進入上皮細胞，經過磷酸化后與蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2結合，所形成復合物可抑制SHP-2的活性，誘導胃上皮細胞的異常遷移和增殖[8-9]。因此cagA及其毒力島基因被認為是胃炎的發生、發展甚至癌變的重要因子。Hp的另一個重要毒力因子是空泡毒素(vacuolating cytotoxin A，vacA)編碼的VacA蛋白，能通過與靶細胞上的受體結合而進入細胞內，使細胞產生空泡性病變，誘導細胞色素C的釋放造成胃上皮細胞的死亡[10]。

伴放線放線桿菌(A.actinomycetemcomitans，Aa)是牙周病的主要致病菌之一，與侵襲性牙周炎密切相關[11-12]。Aa可分泌合成多種毒力因子，能通過改變宿主細胞炎癥細胞因子的表達水平，影響宿主的免疫調節能力，破壞牙周組織[13-14]。研究發現，Aa與胃癌的發病風險高度相關，胃癌前病變患者口腔中的Aa顯著高于健康對照組[1]，提示牙周病和胃癌的主要致病菌間可能存在一定的協同作用。本研究根據Hp的cagPAI基因及vacA基因，用Genebank數據庫并通過同源比對的方法分析Aa中是否存在對應的基因；通過進化樹分析及序列多態性分析，研究進化過程中致病基因的序列變化及其受到的選擇情況，為進一步闡述牙周病和胃癌的相關性提供一定的分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 Aa菌株蛋白序列的獲得

首先從ncbi的下拉框中選擇protein條目，并用關鍵詞A.actinomycetemcomitans查詢Aa的所有蛋白序列；然后在refseq中下載Hp26695的所有cagPAI及vacA基因的蛋白序列，同時利用blastP法查找Aa中對應的蛋白序列(E值為10-5)；最后用在線工具Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)預測cagPAI及vacA基因的蛋白結構域。

1.2 系統進化分析

從NCBI(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genbank/bacteria/)中下載所有包含完整基因組序列的菌株，根據Hp26695的cagE基因序列，并用tblastn的方法獲得除Hp26695外其它菌株中對應的cagE序列。對于有多個菌株的菌種，則根據tblastn的比對結果，選取E值最小的菌株作為該菌種的代表菌株。利用MEGA[15]對所有菌株的cagE進行進化樹分析：首先利用Muscle進行多重比對，比對時使用默認的參數；再用極大似然法(Maximum likelihood，ML)建樹，建樹時bootstrap的值為100，其余參數選默認值。

1.3 cagE序列多態性分析

根據Aa和Hp的蛋白序列，用tblastn法分別查找所有Aa菌株和Hp菌株的cagE序列，經ClustalW多重比對后進行序列多態性分析，DNAsp 5.0法[16]計算比對cagE序列的Pi值和Tajima's D值。Tajima檢驗根據多重比對中每條序列的分離位點數目以及每條序列的核苷酸多樣性值計算得到D值，作為統計檢驗量，利用模擬(simulation)法得到相應的P值。

2 結 果

2.1 Aa中Hp毒力相關基因的查找

從ncbi下載Aa中所有的蛋白序列，共獲得105 610個蛋白序列。根據Hp26695所有cagPAI及vacA基因的蛋白序列，并利用blastP法進行查找，結果發現：Aa中有4個cagPAI基因的同源基因，分別為cagBeta、cagY、cagX及cagE，其中以cagE的E值最顯著(表 1)。然而，在Aa中未發現空泡毒素及其他毒力島基因的蛋白序列。cagY、cagX和cagE均是T4SS的組成成分，與毒素的轉運有關[7]。

Aa中cagE的蛋白序列長度為340 個氨基酸，與Hp中cagE的蛋白序列(983 個氨基酸)相比較短。對Aa和Hp的cagE的蛋白序列進行同源比對時發現，兩者的序列相似性只有18%(圖 1)。 圖 1表明，Aa中cagE的蛋白序列主要比對到Hp的C端區域，當忽略N端未比對的區域后，兩者的相似性可達到40%。

2.2 CagE蛋白結構域分析

用Interpro對CagE蛋白在Aa和Hp兩個物種中的蛋白結構域進行預測顯示，Hp的CagE蛋白主要包含兩個功能域，其中1 個在N端，序列較短(約50 個氨基酸)，具有P型ATP酶活性，屬于跨膜蛋白超家族；另1 個在C端，序列較長(約330個氨基酸)，為核苷三磷酸水解酶的磷酸環，含有該結構域的蛋白傾向于水解ATP或GTP(圖 2A)。Aa的CagE蛋白含有3 個比較明顯的結構域，其N端的結構域較短，為溶菌酶樣結構域超家族的成員；而其C端則與Hp類似，也是包含有核苷三磷酸水解酶的磷酸環結構域，但結構域的長度顯著小于Hp的CagE蛋白(圖 2B)。

2.3 cagE基因系統進化分析

從ncbi中下載所有含完整基因組序列的菌株，同時利用tblastn法，并根據Hp26695的cagE基因序列，查找其它菌株中是否含有cagE基因。對于同一菌種的不同菌株，則選取E值最小菌株的cagE序列作為該菌種的cagE序列。對所有菌種的cagE基因序列進行多重比對后進行系統進化樹分析，結果如圖 3所示：對于多數同屬不同種的菌株，其cagE均聚在同一分支上，如布魯氏菌屬(Breculla)和巴爾通氏體屬(Bartonella)等；然而，Hp與其它螺桿菌屬的細菌并未聚在同一分支上(圖 3中紅色箭頭部分)，表明該屬菌種的cagE序列有較大的變異；進一步分析發現，與其它螺桿菌屬的菌種相比，Aa(圖 3中藍色箭頭部分)在進化樹上更靠近Hp，表明兩者的cagE序列在進化上較為保守。

表1 Aa中Hp毒力相關基因的同源性分析

注：blastP比對后得到的E值，E值越小表示在Aa中無對應蛋白的可能性越大; NA：表示blastP比對后在Aa中未發現對應的蛋白

A:Hp的CagE全長蛋白與Aa的比對； B:Hp的CagE蛋白C端與Aa的比對

圖1Aa和Hp的CagE蛋白保守性分析

Fig 1 Analysis of CagE protein sequence conservation inHpandAa

A: Hp的CagE蛋白結構域； B: Aa的CagE蛋白結構域

2.4 cagE基因DNA序列的多態性分析

從ncbi中下載含有完整基因組的44 個Hp菌株和8 個Aa菌株，tblastn檢驗結果發現，所有Hp菌株中均含有cagE基因，而且在8 個Aa菌株中有4 個菌株含有cagE基因，兩者均顯著高于Genbank中其他菌株的比例(15%)(P<0.05)(圖4)。由此可見，與其他非Hp相比，cagE基因普遍存在于Aa菌株中。

圖3cagE基因系統在細菌中的進化樹分析[紅色箭頭：螺桿菌屬(Helicobacter)； 藍色箭頭：Aa]

Fig 3 Phylogenetic analysis ofcagEin bacteria

圖4 不同種細菌菌株中cagE的比例分析

Fig 4 Frequency analysis of the strains withcagEgene in different group of bacteria

用DNAsp 5.0計算Aa和Hp的cagE基因序列多態性的Pi值，及用Tajima's D計算其進化過程中cagE基因在這兩個物種中所受到的選擇作用。結果顯示，Aa的Pi值顯著高于Hp(P<0.01)，表明Aa中的cagE基因有明顯的序列變化；而Tajima's D值則在Aa和Hp中均為負值，其Tajima's D對應的P值都小于0.01，表明在其進化過程中cagE基因在這兩個物種中均受到了負向選擇的作用(表 2)。

表2Aa和HpcagE基因的序列多態性分析

Tab 2 Polymorphism analysis ofcagEgene inH.pyloriandA.actinomycetemcomitanspopulations

細菌Pi值ThetaTajima'sDP值Aa0.2937a0.3223-0.92647<0.001Hp0.1011b0.1515-1.21566<0.01

注：不同字母為P<0.01

3 討 論

cagA和vacA是Hp的主要致病基因。同時，cagA還是其所在的致病島區域的基因編碼及毒素裝配和分泌機能相關的蛋白，對Hp毒性的發揮具有重要作用。本文通過生物信息學方法，分析了Hp致病島區域的基因以及vacA基因在Aa中的存在及序列變化情況，發現Aa中并不存在cagA和vacA基因，但卻存在cagE等其它4 個致病島區域的基因。與其他物種相比，Hp和Aa中的cagE基因有著較近的進化距離，在蛋白的C端均含有核苷三磷酸水解酶的磷酸環結構域，且該基因在這兩個物種內都受到負性選擇的作用。

cagE位于cagPAI的右半部分，主要定位在胞質內的ATPase，即可為分泌系統的組裝及底物轉運提供能量，又能與其他蛋白組成T4SS，對CagA轉運有重要作用[17-18]，而且在Hp的大部分菌株中都含有該基因。大量研究表明，cagE還與細胞的炎癥反應有關。以往的研究發現，感染Hp的cagE陽性菌株后，AGS和KATO-III等胃癌細胞的炎癥反應重要因子IL-8表達升高[18]。有研究表明，十二指腸潰瘍與患者感染Hp的cagE陽性菌株有關[19]。近年來的一些研究表明，在Aa中也存在cagE基因[20-21]。但與Hp不同的是，并不是所有的Aa菌株都含有cagE基因，該基因只存在于一部分Aa亞型的菌株中[20]。Aa菌株的cagE基因在牙周病中也扮演十分重要的角色[21]。與cagE陰性菌株相比，cagE陽性菌株有著更為顯著的白細胞毒性，能作為一個重要的毒力因子而利于Aa菌株更好的定植在口腔中[20]。

對于其它3個在Aa中出現的Hp毒力島區域基因，cagX和cagY也是Type IV分泌系統組成成分，并在Hp中與CagA 的轉運有關[7]。在G-菌中有6種分泌系統[22]，T4SS所分泌的蛋白末端有一信號肽序列，其成份主要是疏水性氨基酸，可以引導蛋白穿過細胞內膜而到達目標區域[23]。由于T4SS能直接將毒素蛋白或毒素復合物等大分子物質注入到宿主細胞中，并進而參與病原-宿主間的相互作用，因此在病原菌毒性發揮中具有重要意義[7,24]。T4SS還能介導細菌吸收外界物質，如Hp能通過T4SS的ComB系統從外界環境中獲得外界DNA序列[25]。Hp和Aa兩種細菌中多個T4SS的蛋白組分的序列保守暗示兩者在結構和功能上存在一定的相似性，因而可能有利于細菌間物質的交流和傳播。

本課題組最近的一項研究表明，牙周病患者有較高的胃癌前病變風險，且該風險與患者口腔中較高的Aa菌株水平有關[1]。本文通過對Hp中毒力島基因以及空泡毒素基因在Aa中的存在情況及其序列變化的生物信息學分析發現，兩種細菌中T4SS的部分組分特別是CagE蛋白存在一定的保守性。結果揭示了兩種疾病關鍵的致病菌在分子水平存在一定的相似性，為進一步研究牙周病與胃癌的關系提供了新的思路。

doi:10.1128/microbiolspec