LncRNA調控各類細胞成骨分化的機制研究進展

余楊洋，蔣偉東，朱佩琪 綜述 周 諾 審校

骨缺損是一種以骨喪失為主要特征的常見疾病，多由感染、腫瘤、創傷、手術并發癥等原因造成，嚴重影響患者的生活質量。傳統治療手段主要局限在各種自體骨或人工骨的移植，但由于免疫排斥、感染等可能存在的術后并發癥，完全性的骨愈合率并不高[1]。得益于生物組織工程學和再生醫學的發展，出現了如牽張成骨等新的骨缺損治療手段[2]。這啟示人們從分子水平研究成骨分化的機制，或許可成為研發新型臨床治療手段的新方向。

隨著人類基因組計劃(human genome project，HGP)的完成，人們發現僅有不足2%的RNA能夠編碼蛋白質。其余無法編碼蛋白質的RNA被統稱為非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)，這當中轉錄本長度大于200 bp的被統稱為長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA，LncRNA)[3]。LncRNA一般具有mRNA的結構特征，但缺少用于編碼多肽鏈的開放閱讀框，它們曾一度被認為是沒有生物學功能的“轉錄噪音”。然而，盡管它們沒有或僅有非常低的蛋白質編碼潛力，卻可在轉錄水平、轉錄后水平及表觀遺傳水平調控基因的表達，從而參與物種進化、胚胎發育、物質代謝和疾病發生等過程，這當中就包括成骨分化[4-5]。目前用于研究LncRNA調節成骨分化的細胞主要有間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)、脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ASCs)、小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)等，該文就各類細胞中LncRNA調控成骨分化機制的研究進展進行綜述，以期為LncRNA調控成骨分化在骨缺損治療領域的理論發展和臨床應用提供參考。

1 LncRNA在成骨中的主要機制

LncRNA不具有或僅有極小的蛋白編碼潛能，且大多表達水平較低，然而很多LncRNA具有類似mRNA外顯子/內含子的長度，剪接模式也相似。隨著對LncRNA功能的逐漸了解，它已被證明可通過不同的機制調控成骨分化過程[6]。近年來世界范圍內涌現出大量對它的研究及報道。根據LncRNA在基因表達過程中調控的階段，將其作用機制主要分為轉錄水平、轉錄后水平和表觀遺傳水平。

在轉錄水平，LncRNA可通過阻斷啟動子與轉錄因子的結合進而調控基因的表達，例如LncRNA MEG3位于BMP4基因附近，可將對BMP4有轉錄抑制作用的轉錄因子SOX2與BMP4啟動子分離，形成一個包含MEG3、SOX2以及BMP4和SOX2共識位點的穩定復合物，從而減少SOX2對BMP4的轉錄抑制，進而促進成骨[7]；此外，LncRNA也可與RNA結合蛋白相互作用從而調節基因表達，例如RNA結合蛋白Lin28A的表達與PDLSCs經誘導后的成骨分化呈正相關，而Lin28A上包含LncRNA TUG1的多個結合位點，是TUG1調控成骨分化過程中的潛在靶點[8]；同時，LncRNA還可通過競爭性結合轉錄因子等方式來調節成骨基因的表達，例如LncRNA HoxA-AS3直接調節關鍵成骨轉錄因子Runx2上H3K27me3的活性，進而抑制骨髓基質細胞(bone marrow stromal cell，BMSCs)的成骨分化[9]。

在轉錄后水平，LncRNA可與mRNA 互補形成雙鏈 RNA，例如前體mRNA Runx2和反義LncRNA Runx2- AS1通過堿基互補配對雜交形成RNA雙鏈，降低了Runx2的剪接效率，抑制了Runx2基因的表達，進而產生對MSCs成骨分化的抑制[10]；此外，LncRNA也可作為內源性競爭性 RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)與mRNA、miRNA相互調控，例如LncRNA TCONS_00041960通過直接海綿吸附miRNA-204-5p和miRNA-125a-3p，分別調控細胞中Runx2和GILZ的表達，從而促進BMSCs的成骨分化[11]。

在表觀遺傳水平，LncRNA可依靠染色質重塑、DNA甲基化或組蛋白修飾這些方式從表觀遺傳水平來調控成骨分化，例如LncRNA ANCR與增強子 EZH2發生作用，后者催化H3K27me3發生甲基化，抑制Runx2基因表達，使得ANCR間接發揮著調控染色質的作用[12]；再例如HOTAIR的下調導致miR-17-5p啟動子DNA甲基化水平降低，從而導致miR-17-5p上調[13]；此外有研究[14]表明，由于HOTAIR對ALPL的調控，在SaOS-2礦化的過程中可通過組蛋白修飾調控ALPL基因的表達。

2 LncRNA在各類細胞中調控成骨分化的機制

2.1MSCsMSCs是一類細胞的總稱。人的間充質干細胞屬于多能干細胞，可像未分化細胞那樣進行體外擴增，也可分化為間充質類細胞。間充質干細胞可分化為多種間充質組織，如骨、關節、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基質等。其中BMSCs形成于發育中的骨髓腔，它在尚未建立造血功能的骨髓中，分裂旺盛，類似前成骨細胞，在體外可專一性的誘導分化為脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞等[15]。文獻檢索的結果顯示，MSCs是目前成骨相關研究中最常使用的細胞，它的成骨分化受多種LncRNA調控。

例如LncRNA H19作為miR-141和miR-22的ceRNA，與miR-141和miR-22結合后下調miR-141和miR-22對Wnt/β -catenin通路的抑制作用，從而促進成骨分化[16]。再例如LncRNA AK141205通過啟動子區H4組蛋白乙?；龠MCXC趨化因子配體-13(CXC chemokine ligand-13，CXCL13)的表達，從而促進BMSCs的成骨分化[17]。再例如LncRNA MALAT1可直接與miR-143結合并負調控其表達，而miR-143可直接結合到Osx基因 3′-UTR上的靶位點，進而抑制Osx的表達。MALAT1通過靶向結合miR-143進而調節Osx的表達，因此被認為是hBMSC成骨分化的正調節因子[18]。LncRNA在MSCs成骨分化中的調控因子、通路以及功能具體見表1。

2.2PDLSCsPDLSCs是一種重要的間充質干細胞，來自牙周韌帶組織，有潛力分化成多種細胞類型，包括骨、脂肪和軟骨系的細胞[38]。有部分學者研究了LncRNA在此類細胞中調控成骨分化的機制。例如異種核蛋白Ⅰ(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein I，hnRNPI)具有一定的RNA結合結構域，是一種結合RNA和剪接信使RNA的蛋白質。LncRNA MEG3通過與mRNA BMP2競爭結合hnRNPI 從而抑制BMP2表達水平，進而抑制成骨分化[39]。再例如LncRNA POIR和miR-182相互抑制，形成一個調控轉錄因子FoxO1的網絡。FoxO1與TCF-4競爭β-catenin和抑制Wnt信號通路從而促進pPDLSCs的成骨分化[40]。LncRNA在PDLSCs成骨分化中的調控因子、通路以及功能具體見表2。

2.3ASCsASCs是一種能從脂肪組織中分離出來的多能成體干細胞，具有自我更新能力、高增殖能力和成骨分化潛能，是一種適合于骨組織工程學研究的細胞類型[44]。例如LncRNA HIF1A-AS2可海綿吸附miR-665，從而上調白介素(interleukin，IL)-6，從而激活PI3K/Akt信號通路，最終促進ASCs成骨分化[45]。LncRNA在ASCs成骨分化中的調控因子、通路以及功能具體見表3。

2.4MC3T3-E1MC3T3-E1是一類小鼠來源、可無限傳代的未成熟成骨細胞，它與成骨細胞有著基本一致的分化過程，是一種有效的研究成骨細胞分化過程的體外模型[48]。這類細胞也引起了部分研究者的注意，例如LncRNA ODSM抑制miR-139-3p表達，miR-139-3p靶向調節ELK1，而ELK1可促進成骨細胞分化。從而使ODSM有抑制成骨分化的作用[49]。LncRNA在MC3T3-E1成骨分化中的調控因子、通路以及功能具體見表4。

2.5 其他細胞除了以上4種提到的細胞，在LncRNA調節成骨分化的其他文獻中還報道了有關骨髓基質細胞、上頜竇膜干細胞、外胚層間充質干細胞、骨肉瘤細胞系、瓣膜間質細胞、人牙濾泡干細胞、大鼠成骨細胞/骨細胞樣細胞的研究。LncRNA在這些細胞成骨分化中的調控因子、通路以及功能具體見表5。

表1 LncRNA在MSCs成骨分化中的調控因子、通路以及功能

表2 LncRNA在PDLSCs成骨分化中的調控因子、通路以及功能

表3 LncRNA在ASCs成骨分化中的調控因子、通路以及功能

表4 LncRNA在MC3T3-E1成骨分化中的調控因子、通路以及功能

大鼠骨肉瘤細胞系(a rat osteosarcoma cell line,UMR106)；外胚層間充質干細胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)；上頜竇膜干細胞(maxillary sinus membrane stem cells,MSMSCs)；人骨肉瘤細胞系(two human osteosarcoma cell lines，U-2OS/SaoS-2)；人成骨細胞系(a human osteoblast cell line，hFOB1.19)；瓣膜間質細胞(Valve stromal cells,VICs)；牙濾泡干細胞(Dental follicle stem cells,DFSCs)

3 總結與展望

隨著對LncRNA的認識不斷深入，這一曾經的“轉錄噪音”已被證明可在轉錄水平、轉錄后水平以及表觀遺傳水平調控基因的表達，從而參與包括成骨分化在內的多種生物調控過程。此文回顧了LncRNA(H19、MEG3、ANCR、HOTAIR等)在各類細胞(MSCs、PDLSCs、ASCs、MC3T3-E1等)中調控成骨分化的研究，大量體內和體外的實驗研究表明LncRNA在成骨分化過程中存在差異性表達，并與miRNA、mRNA、轉錄因子以及RNA結合蛋白等有著明顯的交互作用，激活或抑制了諸如Wnt/β-catenin、TGF-β、NF-κB、BMP/Smad、Notch等信號通路。了解這些作用和分子機制，不僅對研究正常組織的發育有重要意義，而且對研究疾病的發生、發展以及治療手段也具有重要意義。

表5 LncRNA在其他細胞成骨分化中的調控因子、通路以及功能

當然也要認識到，雖然部分研究已經驗證了LncRNA在成骨分化中的具體調控機制，卻仍有大量的實驗僅僅只在功能上驗證了LncRNA促進/抑制成骨分化，其具體的機制仍未闡明。

值得關注的是，在所納入的文獻中，H19在多種細胞中對成骨分化的作用是促進，HOTAIR、ANCR在多種細胞中對成骨分化的作用是抑制，但 MEG3在同種或不同種細胞間對成骨分化的作用卻出現了不同(促進/抑制)。進一步文獻復習后發現，LncRNA的序列保守性較低，且保守性主要體現在其啟動子區域[62-63]。而且，同一種LncRNA的作用在不同物種間卻可能不同甚至截然相反[64]。同時，大約三分之一的人類LncRNA僅來源于靈長類譜系[65]。LncRNA的這些特性增加了將LncRNA的分子功能轉化為實際臨床應用的難度。

綜上所述，LncRNA的調控作用與成骨分化有著密切的聯系，這為豐富骨缺損等疾病的臨床治療手段指明了新的方向。然而，人們對于LncRNA的認識仍遠遠不足，其序列不穩定、功能難以跨物種的特性也為其具體臨床應用帶來了不確定因素。