十二井穴刺絡放血對腦缺血大鼠腦組織缺氧狀態及能量代謝紊亂的影響

高靚 韓寶杰 李蘭媛 徐夢瑤 孟雪

(1天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸臨床部 國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193；2天津中醫藥大學)

腦血管病是一種對人類健康有著嚴重危害的多發病與常見病，具有高發病率、高復發率、高致殘率、高死亡率等特點〔1〕。在全部腦血管病中缺血性腦血管病占主要比重，約為75%，且近年來有升高趨勢，可見其防治的嚴峻性〔2〕。缺血性腦血管病在祖國傳統醫學中屬“中風”范疇，臟腑經絡氣血陰陽失調是疾病發病的主要病因，腦髓病變為其本，臟腑病變為其標，經絡則為委，是本虛標實之證〔3，4〕。因祖國傳統醫學有其獨特之處，為進一步提高腦缺血治療的效果，可考慮采取中醫治療?！秲冉洝分惺状翁岬綄⑨槾逃糜凇爸酗L”的治療，且該治療方法被后來的歷代醫家完善與發展，積累了大量的理論與臨床經驗，其帶來的治理效果理想，治療機理獨特〔5〕。但現有的研究多涉及針刺在腦卒中恢復期的應用，將其直接用于腦卒中急性起病后的治療是否可行尚未見較多報道。目前國內外研究越來越重視腦缺血早期的治療，這對逆轉患者腦神經功能缺損、改善其預后意義重大。刺絡放血即祖國傳統醫學中的刺血療法，十二井穴刺絡放血能夠起到極佳的活血化瘀、活絡通經、開竅啟閉、祛除邪氣、促正氣恢復之效，故認為將其用于腦卒中的治療有重要價值〔6，7〕。但與之相關的研究并不多見。本研究建立腦缺血大鼠模型，給予其十二井穴刺絡放血治療，主要觀察十二井穴刺絡放血對大鼠腦組織缺氧狀態及能量代謝紊亂的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年健康SD雄性大鼠共50只，體重0.25～0.27 kg，平均(0.25±0.01)kg，月齡為2～3個月，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，編號：SCXK(京)2016-0006，飼養于實驗室動物房籠具內(紹豐SIM型、SIR型獨立換氣系統籠具)，溫度：(22±2)℃，濕度≥40%，動物飼養及手術、給藥和取材等各個環節均符合國際動物倫理相關動物福利要求，倫理號(TCM-LAEC2018027)，自由飲食水。術前12 h禁食。

1.2實驗試劑 上海太陽生物有限公司提供的組織型纖溶酶原激活物(tPA)試劑盒(批號：170520)、南京建成生物工程研究所提供的一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(批號：170524)、上海太陽生物有限公司提供的腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(批號：170511)、尼地平注射液由山東新華制藥廠提供(批號170321)、甲醛由開封化學制品提供(批號：170514)、膽固醇購自天津化學制品廠(批號：170510)。

1.3主要儀器及設備 上海第三儀器提供分光光度儀、四川智誠醫療儀器公司提供酶標儀、南京建成生物科技提供的玻璃勻漿器、日本SHIMAPZN提供的精密天平、北京長安科學儀器提供的恒溫水浴箱、上海醫用分析儀器廠提供的離心機、日本OLYMPUS提供的生物顯微鏡。其他材料還包括：一次性注射器、毫針、量杯、量筒、漏斗、燒杯、止血鉗、鑷子、手術剪、吸管、試管、離心管、蓋玻片、載玻片等。

1.4動物模型建立與分組 大鼠均接受紋狀體微透析導管埋植，并在術后隨機選擇10只大鼠作為空白組。除空白組大鼠之外，其他40只大鼠均制備急性腦缺血模型，方法參照文獻中線栓法〔8〕，并進行部分改良，并將建模成功的大鼠納入實驗，隨機分為3組，包括模型組、吸氧組與十二井穴刺絡組。為避免實驗期間大鼠感染或死亡，術后將大鼠置于無墊料鼠盒內，待蘇醒后在放入有墊料的鼠盒，大鼠能夠自行進食與飲水，每日使用碘酒對手術局部消毒。

1.5干預方法 空白組與模型組大鼠不進行其他干預。吸氧組給予50%濃度氧氣吸入60 min，十二井穴刺絡組給予十二井穴刺絡放血：(1)穴位定位：參照《實驗針灸學》〔9〕，模擬家兔十二井穴取穴方法：第一指橈，爪根角旁側0.1 cm處即“少商”；第二指橈，爪根角旁側0.1 cm處即“商陽”；第五指尺，爪根角旁側0.1 cm處即“少澤”；第五指橈，爪根角旁側0.1 cm處即“少沖”；第三指掌側頂端中位，爪根0.1 cm處即“中沖”；第四指尺側，爪根角旁側0.1 cm處即“關沖”；第二趾腓，爪根角旁側0.1 cm即“厲兌”；第一趾脛，爪根角旁側0.1 cm處即“隱白”；第五趾腓，爪根角旁側0.1 cm處即“至陰”等，其余還包括涌泉、足竅陰與大敦。(2)刺絡方法：佩戴無菌手套，一人抓大鼠背部皮膚，頭部固定，一手固定尾部；另一人點刺各個穴位，針刺前應嚴格消毒，以毫針點刺后出血3～5滴為宜。每日上午定時治療，1次/d，左右兩側交替刺絡。治療時間為3 d。

1.6指標檢測

1.6.1腦組織缺氧狀態 對大鼠進行斷頭處理，處死后將頭部皮膚切開，使用咬骨鉗較顱骨掀開，腦組織充分暴露，無菌條件下將大腦組織分為左半球與右半球，將右側腦組織取下后去除小腦，稱重后向內放入適量的10%甲醛溶液固定備用。根據重量體積比為1∶9的比例加入生理鹽水，使用勻漿器制備腦組織勻漿，后以3 000 r/min轉速離心15 min，取上清液檢測腦組織缺氧狀態相關指標，包括NOS、TNF-α、tPA。嚴格按照試劑盒步驟操作，使用酶聯免疫吸附試驗測定tPA含量；在一氧化氮作用下，氧合血紅蛋白氧化為甲基血紅蛋白，活性提示每分鐘每毫克腦組織可以生成1個NOS活力單位(U/ml)；采用液相競爭法測定TNF-α含量。整個實驗期間動物的處理均嚴格符合國家科技部2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》〔10〕。

1.6.2能量代謝紊亂 腦組織的采集與處理同1.3.1，收集樣本后使用分析儀與對應的試劑盒測定樣本內γ-氨基酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量，檢測方法均為高效液相法。

1.7統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1建模結果 40只用于模型建立的大鼠，最終成功建模33只，其他7只大鼠建模失敗并合理處理，將建模成功的33只大鼠隨機分為了模型組、吸氧組與十二井穴刺絡組，各11只。

2.2各組腦組織缺氧狀態相關指標比較 空白組腦組織中NOS、TNF-α水平表達最低，tPA水平最高，后依次為十二井穴刺絡組、吸氧組、模型組，除空白組與十二井穴刺絡組NOS指標無顯著差異外，其余組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

組別nNOS(U/ml)TNF-α(pg/ml)tPA(ng/ml)空白組1030.01±1.421.57±0.0616.78±0.29模型組1134.98±1.491)2.24±0.041)10.32±0.491)吸氧組1133.64±1.611)2)2.10±0.031)2)11.71±0.411)2)十二井穴刺絡組1132.02±1.512)3)1.88±0.081)2)3)13.00±0.791)2)3)F值21.064276.582280.880P值<0.001<0.001<0.001

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與吸氧組比較：3)P<0.05；表2同

2.3各組能量代謝紊亂相關指標比較 空白組GABA、Glu含量最低，后依次為十二井穴刺絡組、吸氧組、模型組，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組能量代謝紊亂相關指標水平比較

3 討 論

缺血性腦血管疾病的發病率是出血性腦血管疾病的3倍左右，具有高發病率、高致殘率、高復發率、高死亡率等特點〔11〕。故疾病的早期檢出與治療極為關鍵。

腦缺血以猝然暈倒、不省人事，伴語言不利、口鼻歪斜、半身不遂等為主要癥狀，起病急，病情變化迅速，與自然界中風性善變特性相近，故古代醫家將這類疾病以“中風”命名，又因疾病發病突然，故稱之為“卒中”，但該病與《傷寒論》中提及“中風”實質各異〔12，13〕。關于腦卒中的病因病機，歷代醫家均有論述，在病因方面經歷了外因到內因論的變化，隨著近現代對腦卒中的不斷了解與研究，認為“氣血不足、腦空”是腦卒中主要病機〔14〕。腦缺血發生時缺血導致的灌注損傷是引起神經元發生不可逆損傷并致殘的關鍵，故如何選穴，并給予患者合理的針刺治療，能夠減少缺血再灌注損傷帶來的影響一直是臨床研究的重點〔15〕。

本研究中采用的刺絡是一種刺血療法，凡屬大熱、氣結、痰凝、血瘀等病癥均可使用該方法治療，由針灸理論來看，刺絡的實施能夠通過調和氣血、祛瘀通絡、祛邪解表、泄熱解毒、急救開竅等途徑來調整機體經絡、臟腑、氣血等功能，故而可考慮將其用于腦卒中的治療〔16〕。然而刺絡放血療法的實際應用價值并未得到較多循證學證據支持，且在選穴方面也有一定爭議。祖國傳統醫學認為腦卒中的病機為氣、血、風、火、虛、痰六端，肝腎虧虛是其根本，這些病機在一定條件下可以相互影響并相互作用導致疾病突然發作〔17〕。故可以根據上述病機為腦卒中的刺絡放血治療選穴。十二井穴是一類由陰引陽的穴位，包括至陰、中充、涌泉、關沖、大敦、少商、商陽、少沖、隱白、少澤等，十二井穴刺絡放血能夠大接經氣，促十二經之氣通調〔18〕。而腦缺血正是因經氣不通、血氣不暢，左右無法環周導致發病，故十二井穴刺絡放血能夠使經氣相通，促左右環周，不失為一種腦缺血有效的治療方法。腦缺血患者在發病后多存在腦組織缺氧，而腦組織缺氧又會導致能力代謝發生紊亂，故觀察十二井穴刺絡放血對腦缺血患者腦組織缺氧及能量代謝紊亂是否有良好影響，便可確定該方法的腦缺血中的應用價值。本研究成功建立了腦缺血大鼠模型，并對其進行分組與治療，結果顯示，在治療3 d后，十二井穴刺絡組大鼠腦組織缺氧狀態改善情況最理想，且患者能量代謝紊亂情況較其他組得到很好的糾正。結果顯示，十二井穴刺絡放血用于腦缺血大鼠的治療用重要的價值，還應在未來多開展類似的臨床實驗研究來證實其治療有效性安全性，以指導臨床制定更為安全有效的腦缺血治療方案，減少患者因腦組織缺血缺氧導致的一系列損傷。

綜上所述，十二井穴刺絡放血能夠減輕腦缺血大鼠一氧化氮神經毒性，改善大腦缺氧狀態，糾正大腦能量代謝紊亂的情況，調節大鼠腦組織微循環，保護腦神經細胞，對阻止腦缺血大鼠腦損傷進一步發展有著積極意義。