骨髓增殖性腫瘤的分子診斷進展

錢 軍

（江蘇大學附屬人民醫院血液科，江蘇 鎮江 212002）

骨髓增殖性腫瘤 （myeloproliferative neoplasm，MPN）是一組表現為粒系、紅系和（或）巨核系過度增生的克隆性造血干細胞疾病。世界衛生組織（World Health Organization,WHO）造血與淋巴組織腫瘤相關分類及診斷（以下簡稱WHO 相關分類）2001 版將此類疾病定義為慢性骨髓增生性疾??；WHO 相關分類2008 版則將其確定為MPN。最新的WHO 相關分類2016 版分型中MPN 包括7個亞型[1]，即慢性髓細胞性白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）、慢性中性粒細胞性白血?。╟hronic neutrophilic leukemia，CNL）、真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）、原發性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）、慢性嗜酸性粒細胞白血病-非特指型 （chronic eosinophilic leukemia,not otherwise specified，CEL-NOS）、骨髓增殖性腫瘤不能分類型（myeloproliferative neoplasms,unclassifiable，MPN-U）（見表1）。

MPN 發病是由于造血干細胞（hematopoietic stem cell,HSC）驅動基因異常所產生的一系或多系髓系成熟細胞克隆性擴增，而不同的驅動基因重排或突變導致的疾病臨床特征、并發癥和疾病進展的風險各不相同，但在疾病初始階段和發展過程中，不同亞型MPN 患者的臨床表現經常重疊、影響疾病診斷。

CML 的分子診斷

一、t(9;22)染色體易位

90%～95%的CML 患者具有特征性的t(9;22)染色體易位[即費城染色體（Philadelphia chromosome，Ph 染色體）]，其余易位則為變異型或隱匿型，因而采用熒光原位雜交或反轉錄聚合酶鏈反應可能檢出BCR-ABL1 融合基因。絕大多數的CML 可見BCR 基因外顯子12～16（M-BCR）斷裂所形成的融合基因蛋白p210，罕見病例（＜2%）可見BCR 外顯子1～2 斷裂（約1.2%）形成的融合基因蛋白p190、外顯子17～20 斷裂形成的p230 融合蛋白（約0.3%）、外顯子6 斷裂形成的p185 蛋白，亦有報道e8a2 等其他融合基因等[2-4]。因此，當常規核型分析未能檢出典型或變異型t(9;22)，熒光原位雜交未能發現BCR-ABL1融合信號，且反轉錄聚合酶鏈反應未能檢出p210、p190、p230 融合蛋白轉錄本時，則排除CML 的可能性大。

表1 MPN 的歷年WHO 分型

二、BCR-ABL1 重排和JAK2 突變

BCR-ABL1 重排和JAK2 突變分別是Ph 染色體陽性（+）CML 和Ph 染色體陰性（-）MPN 發病的不同驅動因素，一般認為兩者不會共存。2018 年，美國對2005 年至2015 年間1 570例疑診為MPN 的患者開展多中心的研究揭示，BCR-ABL1 和JAK2 共陽性率達0.4%[5]。2017 年，德國一項研究在10 875例確診的MPN 患者中發現，有0.2%的患者為BCRABL1 和JAK2 突變共陽性[6]。但在此之前，意大利的研究者在BCR-ABL1 陽性CML 患者中發現JAK2 V617F 突變率達2.5%（8/314例）[7]。由于CML患者一般不會同時檢測JAK2 突變，因此目前研究者對于BCR-ABL1 重排和JAK2 突變共存的確切發生率并不明確。迄今為止，已有超過40例BCRABL1 合并JAK2 突變的MPN 病例被報道，43%的患者為同時存在，39%的患者為先有JAK2 突變（多為PV）后繼發BCR-ABL1 重排，18%的患者為先有BCR-ABL1 重排后繼發JAK2 突變（多為骨髓纖維化和ET）[5,8]。因此，當CML 患者經酪氨酸激酶抑制劑治療后無明顯改善，或者改善后再次出現白細胞和（或）血小板計數增高、脾臟腫大，除了懷疑疾病進展外，也要排除繼發或轉為其他MPN 的可能。

CNL 的分子診斷

CNL 是一種罕見的MPN，其特征是外周血中性粒細胞持續性增多以及由中性粒細胞所致的骨髓過度增生和肝脾腫大[9]。診斷CNL 時，需要排除反應性中性粒細胞增生、BCR-ABL1p230相關的中性粒細胞性慢性髓細胞性白血病 （neutrophilic CML,CML-N）、骨髓增生異常綜合 征（myelodysplastic syndrome,MDS）/MPN（見表2）。

現在已知CNL 的發病與CSF3R 突變明確相關，而該基因突變存在膜近端點突變和截斷型突變2 種類型。前者多位于第14 外顯子,T618I 和T615A常見，這些突變導致受體發生非配體依賴性的自發性活化，激活Janus 激酶/信號轉導及轉錄激活（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT）途徑、誘導增殖和生存信號，攜帶此突變的患者對蘆可替尼治療敏感；后者多位于第17 外顯子，主要為無義突變或移碼突變（如D771fs、S783fs、Y752X、W791Z），導致轉錄提前終止，從而形成截斷型CSF3R 胞內段，而截斷型CSF3R 發生過表達，在與粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor,G-CSF） 結合后激活SFK-TNK2 途徑，攜帶此類型突變的患者對達沙替尼治療敏感[9-10]。88%的CNL 患者為CSF3R第14 外顯子T618I 突變，其中大多數患者為單獨發生，少數可合并截斷型突變；部分CNL 患者可合并 SETBP1、ASXL1、SRSF2、TET2、U2AF1、NRAS 和CBL 突變[9-10]。盡管CSF3R 突變亦可發生于不典型慢性髓細胞性白血病 （atypical chronic myelogenous leukemia,aCML）患者，但鑒于CSF3R T618I 等活化型突變在CNL 中的特異性，WHO 2016 版相關診斷標準將其確定為CNL 的診斷性分子標志物。因此，如果在aCML 患者中發現CSF3R 突變，則要對其進行仔細的形態學評價，以防將CNL 誤診為aCML。

CEL-NOS 的分子診斷

一系列反應性或克隆性疾病可發生嗜酸性粒細胞增多癥（hypereosinophilia,HE），引起HE 的疾病眾多。嗜酸性粒細胞浸潤和顆粒物釋放可能導致危及生命的器官損傷[11]。2011 年，嗜酸性粒細胞疾病和綜合征工作組會議將除了嗜酸性粒細胞增多綜合征（hypereosinophilic syndrome,HES） 之外的HE 分為4 種類型，即遺傳性（家族性）HE(HEFA)、意義不明的HE(HEUS)、原發性[克隆性和（或）腫瘤性]HE(HEN)、繼發性（反應性）HE（HER）[12]。這4 種類型并不代表最終診斷，而是為了指導進一步的診斷評估。CELNOS 是排他性診斷，必須排除其他伴有HE 的髓系腫瘤或淋系腫瘤（myeloid or lymphoid neoplasms associated with eosinophilia，MLN-eo）、造血干細胞腫瘤，如伴有HE 和基因重排的MLN-eo （包括PDGFRA、PDGFRB、FGFR1 重排 或PCM1-JAK2 的MLN）、CML-eo、AML-M4-eo、伴有HE 的系統性肥大細胞增多癥、MPN-eo。PDGFRA、PDGFRB、FGFR1重排或 PCM1-JAK2、BCR-ABL1、CBFβ MYH11、c-KIT D816V 突變、JAK2 V617F 突變等可資鑒別。

當前，研究者對CEL-NOS 的基因異常尚缺乏系統性研究，在嗜酸性粒細胞增多的特定背景下，ASXL1、TET2、EZH2等基因突變的檢出有助于CEL-NOS 的診斷。但必須注意DNMT3A、ASXL1、TET2 突變是非血液腫瘤老年人群中意義未明的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential,CHIP）的常見突變，如檢出，要仔細排除合并HER。最近，歐洲學者在1 715例HE 患者中發現，27例 （7例初始診斷為HES、20例為髓系腫瘤）患者可檢出STAT5B N642H 突變，并且對4例患者的T 細胞進行了STAT5B N642H 突變檢測，結果提示4例均為陰性，這些患者的總體生存時間僅為30個月，故建議將伴STAT5B N642H 突變的伴HE 髓系腫瘤歸類為CEL-NOS[13]。

表2 CNL、aCML、CMML 和MDS/MPN-U 比較

PV 的分子診斷

一、JAK2 突變

紅細胞增多通常反映了體內紅細胞總量的增加（紅細胞增多癥），但有時可能是由于血漿體積減少（假性紅細胞增多癥）。紅細胞增多癥由多種遺傳性和后天性疾病引起，可分為原發性或繼發性。檢測內源性促紅細胞生成素 （erythropoietin，EPO）濃度，如降低，則傾向排除繼發性因素。超過95%的PV患者存在JAK2 V617F 突變，3%的患者具有JAK2外顯子12 突變，JAK2 V617F 突變或外顯子12 突變的檢出有助于PV 診斷[14]。最近一項包含27 078例病例的薈萃分析揭示，PV 中的JAK2 V617F 突變檢出率在46.7%～100%[15]，而該檢出率差異較大可能由于以下3 點原因。①方法學不同；②存在JAK2外顯子12 突變或其他罕見位點突變；③未能排除其他先天性疾病。因此，如患者的EPO 濃度降低而JAK2 V617F 和外顯子12 突變檢測為陰性時，需排除先天性促紅細胞生成素受體突變；如EPO 濃度正常而JAK2 V617F 和外顯子12 突變檢測為陰性，則要進一步排除氧調節相關基因VHL 的先天性突變以及高氧親和血紅蛋白病、高鐵血紅蛋白血癥、2,3-雙磷酸甘油酸變位酶缺乏癥。

二、其他分子

除了JAK2 突變之外，PV 患者不存在MPL 突變和CALR 突變，但可發生DNMT3A、TET2、ASXL1、SH2B3、CEBPA、SRSF2、IDH2、CBL 等突變[16-18]，其 中ASXL1、SRSF2 和IDH2 突變可能與骨髓纖維化轉化及白血病進展相關[17-18]。

ET 的分子診斷

ET 是巨核系優勢增生伴血小板計數增高（≥450×109/L）的MPN，鑒別診斷需排除引起血小板增多的其他克隆性或反應性原因，尤其是需要與纖維化前期PMF（pre-PMF）及隱性PV（masked PV）鑒別，主要是通過骨髓組織病理學檢查進行區分，基因異常檢出無助于ET 與pre-PMF、PV 的鑒別。絕大多數ET 是由JAK2、CALR 或MPL 的體細胞突變所驅動，JAK2 V617F、CALR 和MPL W515 突變發生率分別為50%～60%、25%～35%和3%左右，其檢出有助于ET 的診斷。10%～12%的ET 患者為三基因（JAK2、CALR 和MPL）突變陰性，但需要注意的是，許多單位的檢測是針對三基因的熱點突變位點（JAK2 V617F 和外顯子12 突變、MPL W515L/K/R/A/N/G/S 突變、CALR 基因52 bp 缺失的Ⅰ型突變L367fs*46 和5bp 插入的Ⅱ型突變K385fs*47）。因此，即便是在所謂的“三陰性”患者中，如果針對全部外顯子均進行測序的話，仍可能檢出其他位點的罕見突變，如JAK2 G127、CALR S189N/E381A、MPL T119/S204/E230/Y252/E259/S505/Y591 等[19-21]，這些少見位點突變的檢出也有助于確定疾病的克隆性，排除反應性血小板增多。

此外，研究者對于JAK2、MPL 和CALR 胚系突變的影響認識還不足，胚系突變的檢出要求臨床醫師需小心求證遺傳性或家族性血小板增多癥可能，如家族性ET 相關的JAK2 T875N 胚系突變可引起STAT3、STAT5 活性增強并促進細胞增殖[22]。JAK2、CALR、MPL 三基因突變可伴隨 TET2、ASXL1、DNMT3A、SF3B1、CEBPA、SH2B3、ZRSR2、CSF3R、EZH2、TP53、IDH2、U2AF1 等基因突變，但如JAK2、CALR、MPL 中任意基因伴隨SF3B1 突變時需謹慎鑒別ET 與MDS/MPN-環形鐵粒幼細胞（ringed sideroblasts，RS）-血小板增多（thrombocytosis，T）。ET 患者檢出SH2B3、IDH2、SF3B1、U2AF1、EZH2 和TP53 突變提示可能預后不良[17]。此外，天津血液研究所報道，JAK2、CALR、MPL 三基因突變陰性患者中常見 TET2 （33.82% ）、SH2B3（29.41%）和ASXL1（23.53%）突變[21]。

PMF 的分子診斷

骨髓纖維化分為原發性和繼發性，后者可由感染、自身免疫性疾病、毛細胞白血病或其他淋巴腫瘤、轉移性腫瘤等所致。WHO 相關分類2016 版將PMF 分為pre-PMF 和明顯的PMF（overt-PMF）。除要排除繼發性骨髓纖維化外，PMF 尤其是pre-PMF還要與ET、MDS/MPN-RS-T、慢性粒單核細胞白血?。╟hronic myelomonocytic leukemia，CMML）等 相鑒別（見表3）。目前只能通過單核細胞計數、巨核細胞形態、紅系增生及發育異常等形態學特征來進行區分，這些疾病在分子改變上具有較大重疊。JAK2 V617F、CALR 和MPL W515 基因突變發生率在PMF 中分別為50%～60%、30%左右和5%～8%[1,23-24]。約12%的PMF 患者為JAK2、CALR、MPL三陰性，可有ASXL1（31%）、SRSF2（17%～23%）、SF3B1（7%～14%）、U2AF1（5%～16%）、EZH2（5%～7%）突變[1,25-26]。CALR 突變陰性和ASXL1、SRSF2、EZH2、IDH1/IDH2 突變陽性已作為預后不良因素被納入MDS 的國際預后指數系統 （MDS international prognostic scoring system,MIPSS）70+V2.0預后系統；CALR 突變陰性以 及ASXL1、SRSF2、U2AF1Q157 突變陽性作為不良因素被納入遺傳預測評分系統（genetically inspired prognostic scoring system，GIPSS）[26]。

表3 PV、ET、PMF 和MDS/MPN-RS-T 比較

MPN-U 的分子診斷

WHO 相關分類2016 版將那些具有明確的MPN 臨床、實驗室、形態和分子特征但不符合任一特定MPN 亞型診斷標準的病例，或者具有2個或多個MPN 亞型重疊特征的病例歸入MPN-U[1]。既往認為，MPN-U 占MPN 的8.6%～30.0%[27-28]，但WHO相關分類2016 版的精確分型使MPN-U 比例減少[28]。目前，MPN-U 通常包括3個亞類：①PV、prePMF或ET 的早期階段，其臨床表現尚不符合各自的診斷標準；②MPN 晚期階段，由于顯著的骨髓纖維化、骨硬化或原始細胞增多等疾病進展和（或）出現發育異常使潛在的疾病被掩蓋；③具有MPN 的明確證據，但由于并存的腫瘤或炎癥性疾病使常見的診斷性臨床和（或）形態學特征被掩蓋。如果患者不符合某一特定亞型的MPN 診斷標準，則必須首先考慮其很可能不是MPN，要排除感染、炎癥、藥物、腫瘤等所致的骨髓反應性增生。JAK2、CALR或MPL 突變可確立MPN-U 診斷，其發生率分別為67%～72%、9%～11%和0～3%；在三基因突變陰性的情況下，髓系腫瘤相關的其他突變檢出 （如ASXL1、EZH2、TET2、IDH1/IDH2、SRSF2、SF3B1 等）有助于確認克隆性造血的存在，但目前缺乏MPNU 基因突變譜的系統性研究。

此外，獲得性克隆性突變也可能發生于沒有髓系腫瘤的健康老年人的造血細胞中。因此，對于基因突變分析要在特定的臨床背景下謹慎解讀。

結語

MPN 是由不同驅動基因突變或重排引起的一組異質性克隆性疾病，在生物學及疾病表型上復雜多樣。隨著遺傳學技術的不斷進步，MPN 的概念和分類得以不斷更新，病理生理學認識得以不斷深入，診斷、預后評估和治療管理得以不斷完善。

盡管在MPN 生物學方面取得了極大進展，但一些重要的基本問題如相同的遺傳事件 （如JAK2 V617F 突變）如何導致不同的臨床表型仍然未得到很好地解決。單細胞測序對于闡明MPN 中不同分化細胞的克隆構成、克隆演變將會產生巨大的推動作用。對于這些問題的解答也必將會產生臨床轉化，使MPN 患者的疾病管理、并發癥處理、預防及精準個體化治療研發得到進一步改進。