桑樹ISSR-PCR反應體系建立及優化

劉玲 唐仕成 鄭丹 柯皓天 呂銀

摘要：采用正交試驗設計L16（45）對桑樹ISSR-PCR反應體系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5個因素及反應程序中變性時間、退火時間、延伸時間和循環數進行優化分析。結果表明，各因素水平變化對反應體系的影響大小依次為DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。最終確立了最佳反應體系，即在10 μL反應體系中，含25 ng/μL DNA模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL。優化得到的反應程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s，合適的退火溫度退火45 s，72 ℃ 延伸90 s，40個循環;72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。通過梯度PCR，確定引物ID37的退火溫度為49.5 ℃。穩定性檢測表明該體系能用于桑樹ISSR分析。

關鍵詞：桑樹;正交試驗設計;ISSR-PCR;反應體系優化

中圖分類號：S888.2 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0080-05

收稿日期：2019-05-15

基金項目：四川省科技計劃（編號：2019YJ0291）。

作者簡介：劉 玲（1989—），女，山西大同人，碩士，工程師，主要從事桑樹分子標記工作。E-mail：liuling1022@yeah.net。

桑樹是?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.）多年生木本植物，是重要的經濟植物，桑葉是家蠶的主要飼料。我國地域遼闊，生態環境各異，經長期的自然選擇和人工選育，形成了非常豐富的桑樹種質資源。研究桑樹的遺傳多樣性及其親緣關系對桑樹的栽培育種、良種選育等有重要意義。

簡單重復序列間擴增（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）標記是一種基于微衛星序列發展起來的分子標記，以PCR技術為基礎，利用真核生物基因組中廣泛存在的微衛星序列設計引物，對2個距離較近、方向相反的SSR序列之間的基因組片段進行擴增。ISSR分子標記技術結合了RAPD和SSR分子標記的優點，穩定性和重復性好，多態性高。國內外眾多研究者已將ISSR分子標記技術應用于桑樹種質資源的遺傳多樣性研究等方面[1]。

本研究參考以往桑樹ISSR研究，采用正交設計和極差分析結合的方法，對桑樹ISSR-PCR反應體系中的5個因素：模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶，進行4個水平優化，并對反應程序中的變性時間、退火時間、延伸時間和循環次數進行正交設計優化，以期建立適合于桑樹ISSR分析的PCR反應體系，為ISSR分子標記在桑樹上更廣泛地應用提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料采自四川省絲綢科學研究院桑樹種質資源圃。選擇品種資源“團桑10號”作為PCR反應體系、反應程序和引物退火溫度優化的模板。

擴增引物參考由加拿大英屬哥倫比亞大學UBC公司2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR分子標記在桑樹方面的應用研究結果[2]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。經初步試驗，選擇擴增片段清晰的引物ID37（5′-GAGGAGGAGGAGGC-3′）作為建立反應體系的固定引物。PCR反應所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×buffer均購自TaKaRa公司。

1.2 基因組DNA提取及質量檢測

基因組DNA提取參照CTAB法，從約0.15 g硅膠干燥的嫩桑葉中提取。DNA質量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度用微量紫外分光光度計檢測確認。

1.3 ISSR-PCR反應體系的建立及優化

PCR反應體系中的5個因素：模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶，每個因素分別設置4個水平（表1）。采用L16（45）正交設計（表2），共16組反應體系。每組還含有1 μL 10×buffer。優化模板為團桑10號，引物為ID37，每個反應體系設2次重復。

對正交設計試驗結果進行直觀分析和極差分析，確定2種方法各自的最佳反應體系;若結果不同，則分別對這2種體系進行PCR擴增，根據電泳結果確定哪種反應體系效果更好。

PCR反應在Thermal Cycler（上海山富科學儀器有限公司）上進行。初始反應體系（總體積10 μL）：25 ng模板1 μL、10×buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.1 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL，加ddH2O至 10 μL。初始擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性60 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，40個循環;72 ℃延伸10 min，反應結束控制在12 ℃。PCR反應產物經1.5%瓊脂糖電泳檢測后，在紫外投射反射儀下觀察拍照保存。每個反應重復2次。

1.4 ISSR-PCR反應程序的正交試驗

采用優化好的反應體系對PCR擴增程序中的變性時間、退火時間、延伸時間和循環次數進行優化，這4個因素水平設置見表3，擴增程序的優化采用L9（34）正交試驗設計（表4），每個組合重復擴增2次。產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對結果進行直觀分析，確定最終的PCR反應程序。

1.5 引物退火溫度優化

以確定的最佳反應體系為基礎，以提取的“團桑10號”DNA作為模板，對引物ID37的退火溫度進行優化篩選，退火溫度設定范圍為47～53 ℃，PCR儀自動生成12個溫度。PCR擴增后產物用 1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據擴增結果確定引物ID37（表5）的最佳退火溫度。

1.6 桑樹ISSR-PCR最佳反應體系穩定性驗證

用8個桑樹材料：團桑5號、江油12-3、江油19號、江油22號、江油24號、江油402、江油椹1號、白桑，用引物ID7（表5）對優化出的反應體系做穩定性檢測，PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 ISSR-PCR正交反應體系的直觀分析

由圖1可知，除組合2和組合3外，其余各組擴增條帶都存在條帶缺失和不清晰的情況。與第3組相比，組合2的擴增條帶清晰度弱，因此，電泳結果認為第3組合為最優體系，即DNA模板第1水平、引物第3水平、Mg2+第3水平、dNTPs第3水平、rTaq酶第3水平，即10 μL反應體系中含25 ng模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物 0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.3 μL。

為了進一步證明對試驗結果初步判斷的準確性，根據李志勇等對正交設計試驗中的各組分濃度組合進行K值等分析[3]，分析結果見表6。K值代表某水平下某因子參與反應所產生的擴增條帶的總和;k代表某因子在某水平下參與反應所產生的擴增條帶的平均值;R為某因子的極差，即某因子在不同水平下最大平均值與最小平均值之差。

R值的大小反映了該因子對試驗結果影響的大小，R值越大，影響越顯著。根據極差R分析可知，本研究中的5個因素在設定的4個水平內對試驗結果的影響大小依次為DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。

k值反映了影響因素各水平對反應體系的影響情況，k值越大，反應水平越好。模板DNA第1水平最好，引物第3、4水平最好，Mg2+第3水平最好，dNTPs第3水平最好，rTaq酶第1水平最好。即極差分析得到2種最佳反應體系（引物量不同），分別命名為極差1和極差2，每個組合的組分用量如表7。

2.2 正交設計直觀分析和極差分析結果比較

對正交第3組、極差1和極差2的反應體系作PCR擴增并直觀比較。從圖2中可以看到，極差1和極差2的擴增效果差不多，譜帶亮度強，多態性高且比較穩定，都明顯好于正交第3組。反應體系極差1與極差2相比，區別只是引物量少一些。從節約角度考慮，選擇極差1為最佳反應體系，即10 μL反應體系中含25 ng/μL模板1 μL、10×buffer 1 μL、20 μmol/L 引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 08 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 01 μL。

2.3 擴增程序優化

采用優化好的反應體系優化桑樹ISSR-PCR擴增程序，結果如圖3所示。從電泳結果來看，不同組合擴增條帶的深淺、優劣不同。第1、2、4、8、9組合條帶模糊，不好辨認;第3、5、6、7組合條帶相對清晰，其中第3組合條帶最好辨認。因此，選擇第3組合為桑樹ISSR-PCR的擴增程序，即94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性40 s，49.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，40個循環;72 ℃延伸10 min，反應結束后 16 ℃保存。

2.4 引物退火溫度篩選

由圖4可見，退火溫度對PCR擴增結果影響明顯。當溫度高于49.5 ℃時，擴增條帶不清晰或者條帶不全;溫度低于49.5 ℃時，擴增條帶清晰、完全;因此，選擇49.5 ℃為引物ID37的退火溫度。大多數ISSR引物適合較高的退火溫度，且能提高 ISSR-PCR反應的特異性及精確度[4]，故在47.0～49.5 ℃范圍內，選擇了略高的49.5 ℃來退火。

2.5 最佳反應體系和程序穩定性檢測

采用優化得到的ISSR-PCR反應體系，用引物ID7對8個桑樹基因組DNA樣品進行擴增反應，以檢測優化得到的最佳反應體系和反應程序的穩定性，檢測結果如圖5所示。

由圖5可見，引物ID7從8份種質材料中擴增的條帶清晰、穩定、多態性高。表明，經過優化后建立的ISSR-PCR反應體系及程序具有較好的穩定性。

3 討論與結論

本研究通過直觀分析和正交極差分析對比篩選出的最佳體系，結果表明，正交極差分析得到的2組反應體系效果都好于直觀分析效果。直觀分析帶有一定的主觀性，極差分析是通過計算將結果轉換成數字，能更好地對比出各個因素間的相互作用[5]。

本研究優化得到的桑樹ISSR-PCR反應體系為10 μL反應體系中含25 ng模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL。5個因素在設定的4個水平內對試驗結果的影響大小依次為DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。

桑樹ISSR-PCR反應體系僅見思彬彬等在2012年采用正交試驗設計和單因素設計結合的方法優化過[6]，得到的優化體系為25 μL中10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs 0.35 mmol/L、Mg2+ 2.5 mmol/L、rTaq 0.05 U/μL、引物0.4 μmol/L、DNA 4 ng/μL。本研究與之相比，5個因素的濃度只有rTaq和引物相同，可能是由于試驗材料、引物、濃度梯度設置和技術要求不同造成的。

同時，本研究還采用正交試驗設計優化了桑樹ISSR-PCR反應程序中的變性時間、退火時間、延伸時間和循環數，通過電泳檢測PCR產物，得到最適桑樹ISSR-PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性40 s，49.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，40個循環; 72 ℃延伸10 min， 反應結束后16 ℃保

存。穩定性檢驗結果表明，得到的反應體系和程序能夠擴增出清晰的條帶。

本研究得到的反應體系和程序可用于桑樹ISSR分析，為桑樹系統學和種質資源鑒定及遺傳多樣性的研究奠定基礎。

參考文獻：

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[5]張龍進，白成科. 正交設計優化北重樓ISSR-PCR體系[J]. 植物研究，2011，31（1）：105-108.

[6]思彬彬，劉明麗. 桑葉ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 安徽農業科學，2012，40（3）：1329-1331.