蛤蚧生品及不同炮制品對腺嘌呤致腎陽虛模型小鼠的改善作用比較

黃馨慧 王曉珊 劉舒凌 吳燕春 周蓓 張兵 熊桂玉

摘 要 目的：比較蛤蚧生品及不同炮制品對腺嘌呤致腎陽虛模型小鼠的改善作用。方法：將100只小鼠隨機分為空白組（n=10）和造模組（n=90）。造模組小鼠灌胃腺嘌呤（50 mg/kg）10 d以復制腎陽虛模型，空白組小鼠灌胃生理鹽水（0.2 mL/10 g）。將造模成功的70只小鼠按體質量和腎陽虛癥狀程度隨機分為模型組、陽性組（金匱腎氣丸，6.4 g/kg）、蛤蚧生品組（1.2 g/kg）、酒蛤蚧組（1.2 g/kg）和油酥蛤蚧組（1.2 g/kg），每組14只?？瞻捉M和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組小鼠灌胃相應藥物混懸液，20 mL/kg，每天給藥1次，連續給藥14 d。實驗期間，觀察各組小鼠的癥狀和體征情況。末次給藥結束后，測定各組小鼠的腎指數、睪丸指數以及血清中睪酮、皮質醇、尿素氮、肌酐水平，并采用蘇木精-伊紅染色法觀察腎組織病理學變化。結果：與空白組比較，模型組小鼠出現體質量減輕、蜷縮拱背、畏寒肢冷、體毛稀疏等腎陽虛表現;腎指數以及血清中尿素氮、肌酐水平顯著升高（P<0.01）;腎組織可見腎小管上皮細胞排列不整齊、細胞核淡染、細胞質水腫等病理損傷。與模型組比較，蛤蚧生品和各炮制品組小鼠的腎陽虛表現均有不同程度改善（尤以酒蛤蚧組小鼠改善最為明顯），血清中肌酐、尿素氮水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），腎組織病理損傷有不同程度的減輕;此外，蛤蚧各炮制品組小鼠體質量顯著升高（P<0.01），蛤蚧生品組和各炮制品組小鼠腎指數顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與蛤蚧生品組比較，酒蛤蚧組小鼠腎指數以及血清中尿素氮、肌酐水平均顯著降低（P<0.01），油酥蛤蚧組小鼠血清中肌酐水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：蛤蚧生品、酒蛤蚧、油酥蛤蚧對腺嘌呤所致腎陽虛模型小鼠均具有一定的改善作用，其中以酒蛤蚧的作用最為明顯。

關鍵詞 蛤蚧;生品;炮制品;腎陽虛;腺嘌呤;小鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To compare the effects of raw product and different processed products of Gekko gecko on kidney-yang deficiency model mice induced by adenine. METHODS： Totally 100 mice were randomly divided into blank group （n=10） and modeling group （n=90）. Modeling group was given adenine （50 mg/kg） intragastrically for 10 days to induce kidney-yang deficiency model; blank group was given normal saline （0.2 mL/10 g） intragastrically. After modeling， 70 mice were randomly divided into model group， positive group （Jinkui shenqi pill， 6.4 g/kg）， G. gecko crude product group （1.2 g/kg）， wine-processed G. gecko group （1.2 g/kg） and oil-processed G. gecko group （1.2 g/kg） according to body weight and symptoms of kidney-yang deficiency， with 14 mice in each group. Blank group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically; administration groups were given relevant medicine intragastrically （0.2 mL/10 g）， once a day， for consecutive 14 d. During the experiment， the symptoms and signs of mice in each group were observed. After last medication， renal index， testis index and serum levels of T， CORT， BUN and Cr were measured; HE staining method was used to observe the pathological changes of renal tissue of mice in each group. RESULTS： Compared with blank group， the mice in the model group suffered from performance of kidney-yang deficiency， such as weight loss， crouch and arch back， chills and cold limbs， and sparse body hair， while renal index and serum levels of BUN and Cr were increased significantly （P<0.01）. In renal tissue， there were pathological damages such as irregular arrangement of renal tubular epithelial cells， light staining of nucleus and edema of cytoplasm. Compared with model group， performance of kidney-yang deficiency was improved to different extents in G. gecko crude product group and processed product groups （especially in wine-processed G. gecko group）; serum levels of BUN and Cr were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; pathological damage of renal tissue was alleviated in different degrees. In addition， body weight of mice was increased significantly in G. gecko processed products groups （P<0.01）， and renal indexes of mice were decreased significantly in G. gecko crude product group and processed products groups （P<0.05 or P<0.01）. Compared with G. gecko crude product group， renal index， serum levels of BUN and Cr were significantly decreased in wine-processed G. gecko group （P<0.01）， and serum level of Cr was significantly decreased in oil-processed G. gecko group （P<0.05）. CONCLUSIONS： G. gecko crude product， wine-processed G. gecko and oil-processed G. gecko all show a certain improvement effect on kidney-yang deficiency mice induced by adenine， especially wine-processed G. gecko.

KEYWORDS? ?Gekko gecko; Raw product; Processed product; Kidney-yang deficiency; Adenine;Mice

蛤蚧為壁虎科動物蛤蚧（Gekko gecko Linnaeus）的干燥體，其味咸，性平，歸肺、腎經，具有補肺益腎、納氣定喘、助陽益精的功效[1]。蛤蚧的炮制方法主要有凈制、酒制、油酥制，對應的飲片品種為生蛤蚧、酒蛤蚧、油酥蛤蚧[2-3]。傳統炮制理論認為：生蛤蚧質堅韌，氣腥;酒蛤蚧質酥易碎，酒制可矯臭矯味，可借酒行藥勢，增強其補腎壯陽的作用，多用于腎陽不足、精血虧損的陽痿[4];酥制后易于粉碎，腥氣減少，其功效以補肺益精、納氣定喘見長[3]。近年來，對蛤蚧的炮制研究多集中在蛤蚧不同部位的化學成分和藥理作用比較，而對蛤蚧不同炮制品（酒蛤蚧、油酥蛤蚧）的藥理作用是否有區別，筆者未見國內外文獻報道;蛤蚧飲片是否生、熟有別，也缺乏實驗研究。因補腎助陽是蛤蚧的主要功效之一，故本研究擬通過腺嘌呤復制腎陽虛小鼠模型，比較蛤蚧生品及不同炮制品對模型小鼠腎陽虛的改善作用，以期為蛤蚧炮制原理的闡釋及其臨床的合理應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）;BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）;5430R小型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;111B型二兩裝高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）;UniCel Dxl 800型全自動化學發光免疫分析儀（美國Beckman Coulter公司）;P800型全自動生化分析儀（瑞士Roche公司）;CX22型普通光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

蛤蚧購自安徽亳州藥材市場（批號：20180810），經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室樊蘭蘭研究員鑒定為壁虎科動物蛤蚧（G. gecko Linnaeus）的干燥體;陳年會稽山紹興花雕酒（會稽山紹興酒股份有限公司，批號：20161117，酒精度：15%vol）;芝麻油（益海嘉里武漢糧油工業有限公司，批號：20180801）;腺嘌呤原料藥（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A108804，純度：>98%）;金匱腎氣丸（北京同仁堂科技發展股份有限公司，批號：18030641，規格：20 g）;睪酮檢測試劑盒、皮質酮檢測試劑盒（美國Beckman Coulter公司，批號：8321091、832091）;尿素氮檢測試劑盒、肌酐檢測試劑盒（寧波瑞源生物科技有限公司，批號：201901291、2019021101）;氯化鈉注射液（江西省創欣藥業集團有限公司，批號：20180315，規格：500 mL ∶ 4.5 g，即生理鹽水）;蘇木精染液（德州潤昕實驗儀器有限公司，批號：150201）;伊紅染液（合肥博美生物科技有限責任公司，批號：20190108）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SPF級ICR小鼠100只，雄性，體質量（34±1） g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。小鼠在室溫22～26 ℃、相對濕度40%～60%的實驗室中飼養，飼以普通飼料和純凈水。實驗過程中對動物的處置符合相關動物使用倫理學原則。

2 方法

2.1 藥物的制備

2.1.1 蛤蚧飲片的炮制 （1）蛤蚧生品：取蛤蚧干燥體200 g，去頭（齊眼處切除）、足、鱗片，切成小塊，即得[2-3]。（2）酒蛤蚧：取蛤蚧干燥體50 g，用黃酒浸潤（每1 g蛤蚧樣品用0.2 g黃酒），浸透后，置于溫度為110 ℃的烘箱中烘制20 min，至外表略成微黃色并伴有焦香氣，即得[2-3]。（3）油酥蛤蚧：取蛤蚧干燥體50 g，涂上芝麻油，置于110 ℃的烘箱中烤至色稍黃、質脆，然后去頭（齊眼處切除）、足及鱗片，切成小塊，即得[3]。

2.1.2 蛤蚧生品及炮制品混懸藥液的制備 將蛤蚧生品、酒蛤蚧、油酥蛤蚧分別粉碎，過60目篩，稱取適量粉末，加水制成質量濃度均為0.06 g/mL的3種單一樣品混懸藥液，備用。

2.1.3 陽性藥液 取金匱腎氣丸適量，用水溶解后制成質量濃度為0.32 g/mL的混懸液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

取小鼠100只，根據體質量隨機分為空白組（n=10）和造模組（n=90）?？瞻捉M小鼠灌胃生理鹽水（0.2? ? mL/10 g）;造模組小鼠灌胃腺嘌呤（50 mg/kg，灌胃體積為0.2 mL/10 g），連續10 d，以復制腎陽虛小鼠模型[5-6]。造模后，若小鼠體質量下降明顯，并出現蜷縮懶動，神疲蜷臥，反應遲鈍，畏寒肢冷，體毛稀疏、發黃、易脫落、無光澤，大便稀溏等腎陽虛癥狀，可視為造模成功[7]。造模過程中有12只小鼠死亡，剩余78只存活小鼠有明顯腎陽虛體征。剔除造模后過于虛弱的8只小鼠，留取70只造模成功的小鼠進入正式實驗。將這70只小鼠按體質量和腎陽虛癥狀程度均分為模型組、陽性組（金匱腎氣丸，6.4 g/kg）[8]、蛤蚧生品組（1.2 g/kg）、酒蛤蚧組（1.2 g/kg）和油酥蛤蚧組（1.2 g/kg），每組14只。除空白組和模型組小鼠每天灌胃等體積生理鹽水外，各給藥組小鼠均灌胃相應藥物混懸液，給藥體積均為0.2 mL/10 g，每天給藥1次，連續給藥14 d。各蛤蚧飲片組的給藥劑量是根據蛤蚧的臨床人用量換算而得：蛤蚧飲片的臨床人用量為3～6 g[2]，以每日人用量為6 g計，體質量為60 kg的成人的用量為0.1 g/kg，再按體表面積法[9]折算成小鼠的等效劑量為1.2 g/kg。

2.3 指標檢測

2.3.1 癥狀和體征觀察 在實驗過程中，觀察并記錄小鼠的體質量、癥狀和體征情況。實驗結束前1天，根據中醫基礎理論結合腎陽虛表現的“形、遲、淡、寒”證候對各組小鼠的腎陽虛癥狀和體征進行評分[10]，評出每組小鼠中各癥狀和體征級別對應的小鼠只數。各級癥狀和體征表現：與空白組體征相似，為一級;僅表現出自主活動減少、嗜睡，為二級;反應遲鈍、精神萎靡，體毛稀疏，毛（爪、尾）少光澤，為三級;蜷縮拱背，畏寒肢冷，毛發易脫落，毛（爪、尾）無光澤，為四級。

2.3.2 臟器指數、生化指標檢測 取材前，小鼠禁食不禁水12 h。末次給藥1 h后，稱定小鼠體質量，摘眼球取血后，取出腎、睪丸，精密稱質量，并計算小鼠的臟器（腎、睪丸）指數[臟器指數=臟器質量（mg）/體質量（g）]。血樣在室溫下靜置5 h，然后以3 000 r/min離心10 min，分離血清，再按照相應試劑盒說明書操作，測定血清中睪酮、皮質醇、尿素氮、肌酐水平。

2.3.3 腎組織病理學變化觀察 取小鼠右腎，置于4%甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋、切片（厚度約3 ?m），行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學顯微鏡下觀察腎組織病理學變化。

2.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊則組間兩兩比較采用LSD法，若方差不齊則用Dunnetts T3法。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠癥狀和體征觀察結果

在實驗期間，空白組小鼠飲食量和自主活動情況均正常，皮毛滑順，反應靈敏。模型小鼠的飲食量及體質量下降明顯，且有蜷縮懶動，嗜睡，肢體冷，毛發稀疏發黃、易脫落的現象。給藥后，各給藥組小鼠的癥狀和體征較模型組均有一定改善，自主活動次數增加，皮毛光澤度轉好。其中，以酒蛤蚧組小鼠的癥狀和體征恢復最好，小鼠的蜷縮、肢冷、毛發稀疏情況改善明顯。各組小鼠的癥狀和體征分級結果見表1（在給藥期間，模型組小鼠死亡4只、陽性組小鼠死亡2只、蛤蚧生品組小鼠死亡3只、油酥蛤蚧組小鼠死亡3只，因此數量有所減少）。

3.2 小鼠體質量、腎指數和睪丸指數的測定結果

與空白組比較，模型組小鼠體質量顯著減輕、腎指數顯著升高（P<0.01），但睪丸指數差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，酒蛤蚧組和油酥蛤蚧組小鼠體質量顯著增加（P<0.05或P<0.01），各給藥組小鼠的腎指數均顯著降低、睪丸指數均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與蛤蚧生品組比較，酒蛤蚧組小鼠的體質量顯著增加、腎指數顯著降低（P<0.01）。各組小鼠體質量、腎指數和睪丸指數測定結果見表2。

3.3 小鼠血清中睪酮、皮質醇、尿素氮及肌酐水平測定結果

與空白組比較，模型組小鼠血清中尿素氮和肌酐水平顯著升高（P<0.01），而睪酮、皮質醇水平差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，陽性組和酒蛤蚧組小鼠血清中睪酮水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），各給藥組小鼠血清中尿素氮和肌酐水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與蛤蚧生品組比較，酒蛤蚧組小鼠血清中尿素氮、肌酐水平以及油酥蛤蚧組小鼠血清中肌肝水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠血清中睪酮、皮質醇、尿素氮、肌酐水平測定結果見表3。

3.4 小鼠腎組織病理形態學觀察結果

空白組小鼠腎組織結構完整、清晰，腎小球大小正常、形態完整，腎小管管腔大小正常，腎小管管壁形態正常。模型組小鼠腎組織結構、形態有所破壞，腎小球有血栓形成，腎小管上皮細胞排列不整齊、細胞核淡染、細胞質水腫，腎間質水腫充血，部分腎小管的管腔變大，管壁變性水腫。陽性組小鼠腎組織結構破壞較少，腎小球僅有少量血栓形成，腎小管管腔變大的程度及管壁變性水腫的程度較小。蛤蚧生品組、酒蛤蚧組和油酥蛤蚧組小鼠腎組織形態、結構仍有所破壞，腎小球血栓程度與模型組相比有所改善，腎小球上皮細胞仍有不同程度的水腫，腎間質水腫少見，腎小管管腔變大的程度及管壁變性水腫的程度與模型組相比均有減輕。在各給藥組中，以酒蛤蚧組小鼠的病理學形態改善最為明顯。各組小鼠腎組織病理形態學觀察結果見圖1。

4 討論

中醫理論認為，腎陽虛即腎陽氣不足，當腎陽氣不足時，會出現全身機能衰退并伴有陽虛寒盛之象，如精神萎靡、畏寒肢冷、腰膝冷痛、陽痿滑精、婦女不孕、夜尿多、大便泄瀉、水腫、舌淡胖、脈沉弱等[11]。關于腎陽虛證動物模型是否建立成功，目前主要是通過觀察造模動物的癥狀和體征與腎陽虛證的符合程度來判斷[7]。腺嘌呤致腎陽虛模型是研究腎陽虛常用的動物模型之一。腺嘌呤是核酸的組成成分之一，當大量攝入后，高濃度腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下會轉變成極難溶解的2，8-羥基腺嘌呤，堆積于腎小管與腎間質部位，使得腎小管阻塞，導致腎功能衰竭并影響腎組織能量代謝，從而使模型動物呈腎陽虛的表現[11-12]。金匱腎氣丸具有溫補腎陽、化氣行水的功效，是中醫溫補腎陽的經典方劑[7]，其對腺嘌呤所致腎陽虛模型動物的體征、性激素水平和精子質量等均有改善作用[13-15]，故本研究以其作為陽性藥物。

腎陽虛后常存在神經內分泌系統的異常，下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸、性腺軸和甲狀腺軸這三軸可能出現不同環節、不同程度的功能紊亂[11]。血清睪酮是反映性腺軸功能的指標，血清皮質醇是反映下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸的指標，而腎陽虛證在臟器上主要表現為腎上腺皮質的萎縮和睪丸的組織學改變[11]。在腺嘌呤誘導的腎陽虛模型中，因腎小管管腔堵塞引起腎小管腔呈囊狀擴張，腎小管損傷嚴重，隨著病情的進展，出現“大白腎”和腎功能的損傷[16]。測定腎指數和觀察腎組織病理學變化，可直接反映腺嘌呤造模的效果。而血清中尿素氮和肌酐的水平則是反映腎生理功能的重要指標，反映了腎小球的濾過功能，兩者含量升高表示發生了腎陽虛兼證——腎陽虛水泛證[17]。

在本研究中，造模后小鼠出現了飲食量減少、體質量下降、毛發疏松無光澤、蜷縮拱背、畏寒肢冷、精神萎靡、自主活動減少等現象，這與腎陽虛證的表現相符。同時，造模后小鼠還出現了腎指數顯著升高、血清中尿素氮和肌酐水平顯著升高以及腎組織損傷等現象，這進一步提示造模成功。但是在實驗中筆者觀察到，造模后小鼠的睪丸指數、血清中睪酮和皮質醇水平并未出現降低，反而有所升高。而在腎陽虛模型動物中，其睪丸指數、睪酮和皮質醇水平多會降低[18-19]。筆者在查閱相關文獻后，發現在腎陽虛模型動物中其睪丸指數和血清皮質醇水平也有升高的情況[10]，以及在造模不同時間后血清睪酮水平先是無明顯變化而后降低的情況[20]。分析其原因，筆者推測可能是因為腺嘌呤的靶器官為腎，對睪丸和腎上腺皮質的影響為腎衰后的累積損傷。在不同實驗中，腺嘌呤造模的劑量、造模的持續時間不同，可能對動物睪丸指數、血清中睪酮和皮質醇水平的影響不同，但具體原因還有待進一步的研究和探討。本研究結果顯示，蛤蚧生品、酒蛤蚧、油酥蛤蚧給藥后，均能不同程度地改善模型小鼠的腎陽虛體征，降低其血清中尿素氮和肌酐水平，并減輕其腎組織病理損傷。其中，酒蛤蚧和油酥蛤蚧均能顯著增加模型小鼠的體質量;蛤蚧生品、酒蛤蚧、油酥蛤蚧均能降低模型小數腎指數，并降低其血清中尿素氮和肌酐水平。此外，本研究結果還顯示，陽性組和蛤蚧各飲片組小鼠的睪丸指數以及陽性組和酒蛤蚧組小鼠的血清睪酮水平均較模型組顯著升高。推測其原因，可能與金匱腎氣丸溫腎助陽、蛤蚧益精助陽的功效有關。在血清皮質醇水平上，模型組與空白組間比較以及各給藥組和模型組間比較，差異均無統計學意義，這表明在本研究中各藥物可能并未通過刺激腎上腺皮質的分泌來發揮其對腎陽虛模型小鼠的改善作用。

綜上所述，蛤蚧生品、酒蛤蚧、油酥蛤蚧對腺嘌呤所致腎陽虛模型小鼠均有一定的改善作用，且以酒蛤蚧的作用最為明顯，其對模型小鼠腎陽虛癥狀和體征、體質量、腎指數以及血清中尿素氮、肌酐水平的改善作用均優于蛤蚧生品。分析其原因，可能為黃酒味甘、辛，性大熱，能宣行藥勢，而酒蛤蚧借酒協同增效、行藥勢，增強了其補腎壯陽的作用。但制備中醫證候的動物模型仍屬于實驗性工作，而腎陽虛證的臨床表現是多方面的，涉及的身體機能也是多層次的，因此蛤蚧不同炮制品補腎陽的作用還需要多模型、多指標的進一步研究探討。

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（收稿日期：2020-02-22 修回日期：2020-04-20）

（編輯：林 靜）