鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜混合熱聚集行為分析

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(1.渤海大學食品科學與工程學院,國家魚糜及魚糜制品加工技術研發分中心,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.蓬萊京魯漁業有限公司,山東煙臺 265600)

鳀魚,是一種常見的低值海水魚。近十年,國內鳀魚的捕撈量每年為70萬噸左右[1]。鳀魚不僅味道鮮美而且營養豐富,其蛋白質含量占總質量的12%～18%,含有各種必需氨基酸,是一種優質的動物性蛋白[2]。白鰱魚,是一種常見的淡水魚。近十年,國內白鰱魚的養殖量每年為400萬噸左右[1]。雖然白鰱魚的產量很大,但是凝膠特性較常見的阿拉斯加鱈魚、金線魚等海水魚的差,且具有土腥味,嚴重影響了其魚糜制品的品質[3]。魚肉中的蛋白質主要分為三類:鹽溶性蛋白、水溶性蛋白和不溶性蛋白,其中含量最多的是鹽溶性蛋白中的肌原纖維蛋白[4]。魚糜凝膠的形成過程實質上是肌原纖維蛋白的熱聚集過程,其凝膠性能決定了魚糜制品的口感和品質。

魚糜的原材料以海水魚為主,個體較大的海水魚資源正日趨匱乏,而個體較小的低值海水魚產量豐富[5]。將合適比例的淡水魚和海水魚進行混合,是提高混合體系凝膠特性的一種有效措施。國內外學者對混合魚糜的凝膠特性及其熱聚集行為進行了許多的研究。陳漢勇等[6]將帶魚魚糜分別添加到紅杉魚糜和羅非魚魚糜中,兩種魚糜的凝膠特性均得到了改善。當青花魚魚糜與短鯖魚以1∶2 (W/W)混合時,混合魚糜與青花魚魚糜的凝膠強度相近[7]。Abdollahi等[8]分別從鯡魚與鯉魚中分離得到蛋白質,然后1∶1 (W/W)混合后,彈性模量增速提高。對于混合不同種類的魚糜能夠提高凝膠強度的機制,需要進一步研究。

本文主要研究不同混合比例下鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜熱聚集行為,以期能夠為解釋混合魚糜的凝膠特性提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍鳀魚 遼寧大連市鑫榮水產市場;白鰱魚魚糜,AAA級 湖北洪湖市井力水產食品有限公司;食鹽 中鹽榆林鹽化有限公司;Tris 天津市風船化學試劑科技有限公司。

UMC5真空斬拌鍋 德國Stephan機械有限公司;TA.XT-plus型質構儀 英國Stable Micro System公司;DiscoveryDHR-1流變儀、DSCQ2000差示熱量掃描儀 美國TA公司;SORVALL Stratos冷凍高速離心機 美國Thermo公司;NanoBrook粒度儀 美國布魯克海文儀器公司;970CRT熒光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;LabRAM HR Evolution共焦拉曼光譜儀 堀場(中國)貿易有限公司;E-1045鍍金儀、S-4800冷場發射掃描電鏡 日本日立高新技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鳀魚魚肉的制備 將冷凍鳀魚在流動水中進行解凍。對鳀魚進行處理(去頭去尾去內臟)后獲得魚肉,然后在低溫(<10 ℃)下將魚肉斬拌切碎成泥狀,放置于-78 ℃冰箱中貯藏。

1.2.2 設定混合比例 將鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜分別按照0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6和10∶0的質量比混合。

1.2.3 凝膠的制備 將冷凍白鰱魚魚糜和制備的鳀魚魚肉在4 ℃下解凍6 h,切成小塊(約2.0 cm的立方體)。按照上述的比例混合鳀魚魚肉和白鰱魚魚糜,首先空斬3 min,然后加2.5% NaCl進行斬拌3 min,最后在真空(-0.6 Pa)條件下,將水分含量調節到78%,斬拌5 min,整個過程中保持在10 ℃以下。經過二段式加熱形成凝膠(40 ℃加熱30 min,90 ℃加熱20 min),加熱完成后,將凝膠迅速放在冷水中冷卻,然后放置于4 ℃冰箱中備用。測定的指標包括凝膠強度、動態流變和熱穩定性。

1.2.4 凝膠強度的測定 將凝膠樣品于常溫(25 ℃)下切成直徑為2.0 cm，高為2.0 cm圓柱體,使用質構儀測量其凝膠強度[9]。測量參數如下:探針型號P/5s;測前速度1 mm/s;測后速度1 mm/s;壓縮距離15 mm;觸發力10 g。每組樣品平行測量十次。

1.2.5 動態流變的測定 將魚糜凝膠放置于平板間(40 mm),間距為1000 μm。測量參數如下[10]:加熱速率2 ℃/min;加熱范圍20 ℃～90 ℃;固定的掃描頻率0.1 Hz;應變2%。

1.2.6 熱穩定性的測定 根據Susan等[11]的方法稍作修改。準確稱取5 mg魚糜凝膠于鋁盤中并密封,同時以空鋁盤作為空白對照。測量參數如下:起始溫度20 ℃;結束溫度90 ℃;升溫速率10 ℃/min;氮氣流速50 mL/min。由DSCQ2000分析軟件得到樣品相變過程的焓變ΔH。

1.2.7 肌原纖維蛋白的提取 根據李學鵬等[12]的方法稍作修改。將上述設定比例混合的鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜放入料理機中打碎。先加入4倍體積的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.2)提取液,高速勻漿3次,每次勻漿30 s。整個勻漿過程處于低溫環境(<10 ℃)下。再將勻漿液于4 ℃、5000 r/min離心20 min,去除上清液,沉淀再用4倍上述提取液重復提取2次。除去上清液,最后得到的沉淀用10 mmol/L Tris-HCl(含0.6 mol/L NaCl、pH7.2)溶液溶解,將溶解后的樣品于4 ℃、5000 r/min離心20 min,收集上清液,即為肌原纖維蛋白溶液。

1.2.8 蛋白樣品的預處理 取1.2.7制備的不同混合比例下的肌原纖維蛋白溶液,在40 ℃下水浴30 min,即為第一段加熱后的蛋白樣品;再取部分一段式加熱后的蛋白溶液繼續在90 ℃下水浴加熱20 min,即為第二段加熱后的蛋白樣品。將未加熱的肌原纖維蛋白溶液作為對照組,即為未加熱的蛋白樣品。將制備的樣品放置于4 ℃冰箱里備用。

1.2.9 粒徑的測定 使用NanoBrook粒度儀測定粒徑分布。用10 mmol/L Tris-HCl(含0.6 mol/L NaCl pH7.2)緩沖液將不同混合比例的蛋白溶液濃度調成0.5 mg/mL。測量參數如下:測定溫度25 ℃;平衡時間2 min。

1.2.10 內源熒光的測定 使用熒光分光光度計測定內源熒光光譜[13]。用10 mmol/L Tris-HCl(含0.6 mol/L NaCl pH7.2)緩沖液將不同混合比例的蛋白溶液濃度調成2.5 mg/mL。測量參數如下:激發波長295 nm;狹縫均為10 nm;掃描范圍300～450 nm;靈敏度3。

1.2.11 拉曼光譜的測定 根據Poowakanjana等[14]的方法稍作修改。將不同混合比例的蛋白樣品凍干后,放置于載玻片上。使用高分辨率拉曼光譜儀,激發光源為半導體激光器。測量參數如下:激光波長532 nm;功率100%;采集時間60 s;掃描次數3次;光譜分辨率0.6 cm-1;空間分辨率400 nm;拉曼位移范圍400～3600 cm-1。用Alix的方法[15]計算蛋白質二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的百分比。

1.2.12 掃描電子顯微鏡的測定 將凍干后的蛋白樣品,使用鍍金儀進行離子濺射鍍金,然后用掃描電鏡觀察。

1.3 數據處理

實驗數據用SPSS 19.0軟件進行分析和處理(平均差值用95%置信區間進行T檢驗),用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 混合魚糜凝膠強度的變化

破斷力反映的是魚糜凝膠的硬度,破斷距離反映的是魚糜蛋白之間的結合。凝膠強度是破斷力與破斷距離的乘積,是表征魚糜凝膠硬度和彈性的主要指標[16]。圖1為混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜破斷力、破斷距離和凝膠強度的變化。由圖1可知,純白鰱魚魚糜凝膠的破斷力、破斷距離和凝膠強度均高于純鳀魚魚肉(P<0.05)。隨著鳀魚魚肉含量的增加,混合體系的破斷力和凝膠強度先增大后減小。當鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜的質量比例為1∶9、2∶8和3∶7時,混合體系的凝膠強度與白鰱魚魚糜相比顯著提高(P<0.05),由4629.17 g·mm分別提高到7568.01、6804.22和5805.38 g·mm。凝膠強度和蛋白質的變性有關,在加熱過程中,肌球蛋白之間以及肌球蛋白和肌動蛋白之間相互交聯,形成致密的凝膠網絡結構,從而增強凝膠強度。余永名等[17]將鰱魚魚糜與金線魚魚糜以5∶1的質量比混合時,混合魚糜的凝膠強度高于白鰱魚魚糜。將金鯧魚魚肉添加到羅非魚魚糜中,能夠增強混合魚糜蛋白質之間的結合作用,混合樣品的破斷力得到提高[18]，與本實驗的結果相似。

圖1 混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜破斷力(A)、破斷距離(B)和凝膠強度(C)的變化Fig.1 Changes in breaking force(A),breaking distance(B)and gel strength(C)of blended anchovy mince and silver carp surimi注:鳀魚魚肉∶白鰱魚魚糜=0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6和10∶0(全文同);不同字母表示同一指標各組間數據差異顯著(P<0.05)。

2.2 混合魚糜動態流變的變化

動態流變常常用于研究魚糜的熱聚集?；旌削桇~魚肉與白鰱魚魚糜儲能模量(G′)、損耗模量(G″)和阻尼系數(tanδ)的變化如圖2所示。G′能夠反映凝膠的彈性以及轉變溫度,G′值越大,凝膠強度越大[19]。由圖2A可知,在40～50 ℃之間出現了一個過渡峰,其對應的溫度為肌球蛋白的變性溫度[20]。隨著溫度的升高,G′逐漸增大。當溫度升到70 ℃左右時,G′達到最大值,這可能是因為在該溫度下已經形成了完整的凝膠網絡結構[21]。當鳀魚魚肉和白鰱魚魚糜的質量比例為1∶9和2∶8時,G′值相對較高。隨著溫度的繼續升高,G′趨于穩定。從圖2A、圖2B可以看出,在整個升溫過程中,G″值明顯低于G′值,表明混合體系是以彈性為主的穩定體系[22]。tanδ為G″和G′比值的正切值,tanδ值越大,凝膠強度越小[23]。由圖2C得,當鳀魚魚肉和白鰱魚魚糜的質量比例為1∶9和2∶8時,混合體系的tanδ值較低,說明這兩種比例下的凝膠強度較大,與前面凝膠強度的分析結果相一致。

圖2 混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜儲能模量(A)、損耗模量(B)和阻尼系數(C)的變化Fig.2 Changes in storage modulus(A),loss modulus(B)and damping factor(C)of blended anchovy mince and silver carp surimi

2.3 混合魚糜熱穩定性的變化

圖3是混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜加熱過程中的差示熱量掃描圖。在DSC圖中,向上的峰是吸熱峰,代表的是蛋白質的折疊變性行為;向下的峰是放熱峰,代表的是蛋白質的聚集行為[24]。DSC圖中對應的峰面積為焓變值(ΔH),ΔH值越大,表示變性需要的能量越多,其對應的體系穩定性越高[25]。

從圖3中可以看出:各組別在加熱過程中均出現兩個峰,Peak1代表的是肌球蛋白的變性,Peak2代表的是肌動蛋白的變性[26],峰面積代表的是表1中的ΔH。表1是混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜DSC參數的變化。由表1可知,各組別的變性溫度和焓變值都不同。當鳀魚魚肉和白鰱魚魚糜的質量比例為0∶10、1∶9和2∶8時,ΔH1值較高,表明該比例下混合體系穩定性較強。這可能是因為不同來源的蛋白質之間相互作用,提高了混合體系的穩定性。當鳀魚魚肉含量進一步增加時,ΔH1值逐漸減小,表明混合體系的穩定性降低。

表1 混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜熱穩定性的變化Table 1 Changes in thermal stability of blended anchovy mince and silver carp surimi

圖3 混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中的差示熱量掃描圖Fig.3 Differential scanning calorimetry(DSC)in the heating process of blended anchovy mince and silver carp surimi

2.4 混合魚糜中肌原纖維蛋白粒徑的變化

粒徑是蛋白質結構的宏觀表現。不同的溫度和不同來源的蛋白質之間相互交聯都會影響其粒徑的大小[27]。圖4是混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中粒徑的變化。由圖4可知,在加熱前后各組別的粒徑分布都只有一個峰,表明混合體系中形成聚集體的大小比較均一。未加熱時,各組別的粒徑大小分布比較集中,粒徑大部分集中在180 nm處。這說明未加熱時,混合體系沒有發生劇烈變性。經過第一段加熱后,各組別的粒徑與未加熱時相比均提高50%,粒徑大部分集中在400 nm處。隨著加熱的繼續,混合體系的粒徑逐漸增加,第二段加熱后的混合體系粒徑大部分集中在1500 nm處。這表明肌原纖維蛋白經過熱凝膠,通過蛋白質之間的相互作用形成較大的聚集體,從而導致混合體系粒徑的增加[28]。經過二段式加熱后,不同混合比例的鳀魚魚肉和白鰱魚魚糜的粒徑均大于純鳀魚,說明混合體系的蛋白質交聯程度大于純鳀魚的蛋白質交聯程度。

圖4 混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中粒徑的變化Fig.4 Changes in particle size of blended anchovy mince and silver carp surimi during heating注:(A)是未加熱;(B)是第一段加熱;(C)是第二段加熱。

2.5 混合魚糜中肌原纖維蛋白內源熒光的變化

內源熒光光譜經常用來研究蛋白質分子構象和色氨酸、酪氨酸殘基微環境的變化[29]?；旌削桇~魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中內源熒光的變化如圖5所示。未加熱時,各組別的熒光圖譜形狀沒有較大變化,但是其最大熒光強度發生了變化。當鳀魚魚肉與白鰱魚的質量比例為1∶9時,混合體系的最大熒光強度最低,其余混合比例體系的最大熒光強度均處于鳀魚和白鰱魚的中間。其中,鳀魚的最大熒光強度過大,可能是因為鳀魚中所含有的熒光物質含量過多。隨著加熱的進行,混合體系的最大熒光強度明顯減小。與未加熱時相比,第一段加熱后和第二段加熱后最大熒光強度分別降低了38.8%和44.4%,這可能是因為加熱初期蛋白結構變化比較顯著。經過二段式加熱后,混合體系的最大熒光強度降低,表現出熒光猝滅現象,且發生了不同趨勢的紅移現象。其中,當鳀魚魚肉與白鰱魚的質量比例為10∶0、1∶9和2∶8時,紅移趨勢較大。紅移的趨勢越大,表示蛋白質在變性過程中構象改變的程度越大[30]。袁麗等[31]研究得到,隨著溫度的升高,鳙魚的肌球蛋白表現出其熒光猝滅現象顯著,且發生了明顯的紅移現象，與本實驗的結果相似。

圖5 混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中內源熒光的變化Fig.5 Changes in intrinsic fluorescence of blended anchovy mince and silver carp surimi during heating注:(A)是未加熱;(B)是第一段加熱;(C)是第二段加熱。

2.6 混合魚糜中肌原纖維蛋白二級結構的變化

在蛋白質的拉曼光譜中,酰胺Ⅰ帶(Amide Ⅰ)和酰胺Ⅲ帶(Amide Ⅲ)是蛋白質構象的主要特征峰[32]?；旌削桇~魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中蛋白質二級結構的變化如圖6所示。加熱前后,各組別的蛋白質二級結構含量不同。未加熱時,當鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜的質量比例為1∶9和2∶8時,α-螺旋的相對含量較低,這表明在低溫狀態下,不同來源的蛋白之間會發生輕微的交聯。第一段加熱后,各組別的α-螺旋相對含量逐漸降低,β-折疊相對含量逐漸升高,表明在40 ℃時,混合體系發生了一定程度的交聯,當鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜的質量比例為0∶10、1∶9和2∶8時,α-螺旋的相對含量相差不大。隨著加熱的繼續進行,各組別的α-螺旋相對含量繼續降低,β-折疊相對含量繼續升高,但是較第一段加熱后變化不明顯。其中,當鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜的質量比例為1∶9時,α-螺旋的相對含量最低,β-折疊的相對含量最高,表明在該比例下,蛋白質的交聯程度最大,混合體系的穩定性最高。鳀魚魚肉蛋白質二級結構含量的變化與混合體系的不同,可能是因為鳀魚魚肉的熱穩定性較差,受熱后蛋白結構發生了變化。拉曼光譜結果表明,混合體系的α-螺旋含量降低,β-折疊含量增多,有利于蛋白網絡結構的形成[33]。這與前面凝膠強度以及熱穩定性的結果相一致。

圖6 混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中蛋白質二級結構的變化Fig.6 Changes in protein secondary structure fractions of blended anchovy mince and silver carp surimi during heating注:(A)是未加熱;(B)是第一段加熱;(C)是第二段加熱。

2.7 混合魚糜中肌原纖維蛋白微觀結構的變化

掃描電鏡可以直觀地看出蛋白質網絡結構的變化。蛋白質表面越平整,其結構形成的越好[34]。圖7是混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中掃描電子顯微鏡的變化。未加熱時,不同混合比例的微觀結構也不同。說明混合體系在混合初期就發生了輕微的交聯。第一段加熱后,混合體系之間逐漸交聯,表面變得逐漸平整。當鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜的質量比例為0∶10、1∶9、2∶8和3∶7時,混合體系的微觀結構相似。這可能是因為在加熱時蛋白質分子受熱變性,交聯成大的聚集體。第二段加熱后,混合體系的微觀結構更加致密均勻。其中,當鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜的質量比例為1∶9時,混合體系的微觀結構最為致密。

圖7 混合鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜在加熱過程中掃描電子顯微鏡的變化(5000×)Fig.7 Changes in microstructure of blended anchovy mince and silver carp surimi during heating(5000×)注:(A)是未加熱;(B)是第一段加熱;(C)是第二段加熱。

3 結論

混合合適比例的鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜能夠提高混合體系的凝膠強度。通過研究鳀魚魚肉與白鰱魚魚糜在不同混合比例下的熱聚集行為,得到當鳀魚魚肉和白鰱魚魚糜的質量比例為1∶9時,混合體系的熱聚集效果最佳。但由于鳀魚是一種海水魚,其體內可能含有各種內源酶,會增強混合體系的凝膠特性,具體的機理還需進一步實驗研究。