合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性及穩定性研究

劉 鵬,劉瑜倩,蘭太進,黃攢詩,羅榮將,陸安揚,張遠鴻,林 江

(廣西中醫藥大學基礎醫學院,廣西南寧 530200)

馬氏珠母貝(Pinctadamartensii),又名合浦珠母貝(Pinctadafucata),隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamelli branchia)、珍珠貝目(Pterioida)、珍珠貝科(Pteriidae)、珠母貝屬(Pinctada),為我國南方生產海水珍珠的主要貝類,主要分布于我國廣西、廣東、海南[1-2]。合浦珍珠盛產于廣西北海合浦,是我國國家地理標志產品[3-4]。珍珠粉自古藥食同源,千百年來一直被奉為純天然養顏美容、功能性食品,是具有價值的營養成分和生物活性物質的來源[5-6]。研究表明,合浦珍珠的化學成分包括無機物質、有機物質和水。無機物質主要是碳酸鈣[7-9];有機物質主要是小分子活性多肽、多糖、核酸、8種人體必需氨基酸以及十多種與人體新陳代謝相關的氨基酸,且包含一些具有特殊生理活性的非蛋白氨基酸,如?；撬岬?另外還含有銅、鐵、鎂、錳、鈉、鋅、鍶等微量元素,種類齊全,且比例組合形式符合人體需要[10-11]。

合浦珍珠作為傳統名貴的道地藥材,歷代中醫典籍對合浦珍珠的性味功效皆有明確記載,如明朝李時珍所著的《本草綱目》寫道:“珍珠味咸,甘寒無毒。鎮心點目。涂面,令人潤澤好顏色。涂手足,去皮膚逆臚,墜痰,除面斑,止泄。除小兒驚熱,安魂魄。止遺精白濁,解痘療毒”[12];現代典籍《中華人民共和國藥典》及《中藥大辭典》亦記有:“珍珠具有安神定驚、明目去翳、解毒生肌、潤澤肌膚”的功效[13]。合浦珍珠粉因功效顯著且無毒副作用等特點,常出現在各類方劑、保健食品中[14]。如Knijnenburg等[15]報道,納米珍珠粉在健康成人中顯示出良好的鈣吸收和保留性能,可以提高骨骼和血清鈣水平,增加股骨重量和長度;另珍珠粉被臺灣婦女廣泛用作孕期和產后的健康補充劑[16-17];珍珠粉含有豐富的氨基酸、有機鈣、硒、鋅等微量元素,能在短時間內補充機體鈣質,并提供一些微量金屬元素,從而改善免疫系統,可用作高級保健食品的原料[18];珍珠粉具有良好的抗氧化性能,Yang等[19]證實珍珠粉能抑制2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽誘導的人紅細胞氧化溶血、脂質過氧化和紅細胞膜蛋白的氧化損傷;珍珠粉含有豐富的蛋白質,Chiu等[20]以秀麗隱桿線蟲為模型,通過體外和體內實驗,證實珍珠粉蛋白提取物是一種有效的抗氧化劑,能延長線蟲壽命,表明珍珠粉可以作為功能性食品開發,用于一些年齡相關性退行性疾病的保健養生。很多天然物質具有良好的抗菌性能,常被開發為食品或添加劑[21],而合浦珍珠粉作為一種無毒的天然海洋活性物質,關于其抗菌性能的研究目前國內外尚鮮少報道。

本研究以合浦珍珠粉為原材料,采用超聲-酸解-加熱聯合處理法制備合浦珍珠提取物,以金黃色葡萄球菌為試驗菌,采用牛津杯法、二倍梯度稀釋法等評價合浦珍珠提取物的體外抑菌效果,并探討其抑菌活性的穩定性,旨在為綜合利用合浦珍珠這一珍稀藥食兼用海洋生物資源提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

合浦珍珠粉 北海市寶珠林海洋科技有限公司;金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923、胰蛋白胨、酵母膏、氯化鈉、瓊脂粉等常規試劑 北京索萊寶科技有限公司。

UV-1800型紫外可見分光光度計 上海美譜達;Synergy H1型全功能酶標儀 美國BioTek;THZ-300C型恒溫搖床(可制冷) 上海一恒科學儀器有限公司;XY-SH-150-Ⅲ型智能生化培養箱、XY-JH-11C型個人型單面超凈臺 上海昕儀儀器儀表有限公司;SCIENTZ-12N型普通型冷凍干燥機 寧波新芝凍干設備股份有限公司;YXQ-LS-100A型內循環立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;RH basic 2型經濟型加熱磁力攪拌器 德國IKA(艾卡)公司;牛津杯(內徑(6±0.1) mm,外徑(7.8±0.1) mm,高(10±0.1) mm) 江蘇三愛思科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 合浦珍珠提取物的制備 參考Yang等[22]方法并進行一定修改。準確稱取5.0 g合浦珍珠粉末,按1∶40 g/mL比例加入5%醋酸溶液,室溫下超聲破碎,破碎條件:功率250 W,工作時間5 s,間歇時間5 s,全程30 min;隨后室溫下繼續磁力攪拌6 h,調節pH為7.0,再轉移至40 ℃的恒溫箱中磁力攪拌過夜,結束后于沸水中保持15 min,冷卻后4 ℃ 5000 r/min離心15 min,取上清,用1 mol·L-1NaOH溶液調節pH至7.0,凍干成粉,室溫保存。

1.2.2 合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性試驗 采用牛津杯法檢測合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性。從LB固體平板上挑取金黃色葡萄球菌單菌落,接種到5 mL新鮮的LB液體培養基中,37 ℃ 180 r/min振蕩培養4 h至生長對數期,稀釋到1×106CFU·mL-1。移液器移取200 μL菌懸液,均勻涂布于LB固體平板上,用無菌鑷子將滅菌干燥后的牛津杯置于平板表面,輕輕按壓固定,吸取200 μL濃度為200 mg·mL-1的合浦珍珠提取物(pH=7.0)加到牛津杯中,陰性對照組為200 μL無菌水,每組設置三個平行實驗,4 ℃擴散3 h后,正置于37 ℃培養箱中,培養24 h觀察抑菌圈的形成,并使用游標卡尺測量抑菌圈大小[23]。

1.2.3 最小抑菌濃度MIC的測定 采用二倍梯度稀釋法測量合浦珍珠提取物的最小抑菌濃度[24]。方法同上制備金黃色葡萄球菌1×106CFU·mL-1菌懸液。使用無菌96孔板進行最小抑菌濃度檢測,在每孔中加入100 μL稀釋后的菌懸液,隨后加入100 μL不同濃度的無菌水稀釋的合浦珍珠提取物,各組濃度如下:240.00、120.00、60.00、30.00、15.00、7.50、3.75、1.88、0.94、0.47和0.24 mg·mL-1,陰性對照組為無菌水,以不添加菌液和合浦珍珠提取物的LB培養液作為空白對照,每組平行3個孔,置于37 ℃培養箱中培養24 h,隨后使用酶標儀檢測OD600,測定合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的MIC。

1.2.4 合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響 同1.2.2方法,制備金黃色葡萄球菌濃度為1×106CFU·mL-1的菌懸液。對照組為無菌水,實驗組為0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC、64×MIC和128×MIC,迅速混勻置于37 ℃靜置培養。合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的生長影響實驗時間點選擇0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51 h 18個時間點,以不添加菌液和合浦珍珠提取物的LB培養液作為空白對照,每組設置三次平行實驗,采用96孔法檢測合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響。

1.2.5 溫度對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 采用7.5 mg·mL-1濃度的合浦珍珠提取物進行實驗,將其分別在-80、-20、4、25、37、60、80和100 ℃下處理30 min,以金黃色葡萄球菌為指示菌,設置三次平行實驗,采用96孔法分別檢測不同溫度對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.2.6 反復凍融對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物進行實驗,將其置于-20 ℃冷凍,隨后室溫下快速解凍,凍融次數分別為0、1、2、3、4、5和6次,以添加等體積的無菌水作為對照,設置三次平行實驗,采用96孔法分別檢測反復凍融對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.2.7 pH對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 將120 mg·mL-1合浦珍珠提取物分別與pH為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0的無菌水以1∶1的比例混合,置于4 ℃ 24 h,再將所有組別pH調至7.0,且用無菌水分別將其體積調為一致確保合浦珍珠提取物的濃度一致,最終采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物進行實驗,采用96孔法分析不同pH對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.2.8 紫外線照射對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物進行實驗,將其敞開放置在20 W紫外燈光下,分別照射0、5、10、15、20、25和30 min,以金黃色葡萄球菌為指示菌,設置三次平行實驗,采用96孔法檢測紫外線對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.2.9 金屬離子對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 采用7.5 mg·mL-1的合浦珍珠提取物進行實驗,使用15 mg·mL-1的合浦珍珠提取物分別與不同濃度0、25、50、100和200 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2溶液等體積混合,設置三次平行實驗,置于37 ℃處理1 h,隨后采用96孔法分析不同離子強度對合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響。

1.2.10 胰蛋白酶與胃蛋白酶對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響 將胰蛋白酶加入pH為7.0的30 mg·mL-1的合浦珍珠提取物中,胃蛋白酶加入pH為2.0的30 mg·mL-1的合浦珍珠提取物中,酶的終濃度均為1.0 mg·mL-1,37 ℃處理1 h,再用100 ℃處理5 min,終止酶反應,室溫12 000 r/min離心5 min,收集上清,調節pH為7.0,過濾除菌,使用7.5 mg·mL-1濃度的合浦珍珠提取物進行實驗,未經酶處理的合浦珍珠提取物作為對照,設置三次平行實驗,采用96孔法分析蛋白酶對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響。

1.3 數據處理

所有實驗數據采用Graphpad prism 6.0分析合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用,SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析,P<0.05,表明具有顯著性差異,P<0.01,表明具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 合浦珍珠提取物的制備及對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

本實驗采用超聲破碎聯用酸解法制備合浦珍珠提取物,凍干成粉(如圖1A),使用無菌去離子水溶解為240.00 mg·mL-1,用于后續實驗。采用牛津杯法檢測合浦珍珠提取物抑菌活性,根據是否有抑菌活性判斷標準進行判斷:抑菌圈直徑大于6 mm判斷為有抑菌活性,小于等于6 mm為無抑菌活性;3次重復實驗均達到有抑菌活性結果者判為合格。陰性對照組應無抑菌圈,否則實驗視為無效[25]。其中抑菌圈直徑大于6 mm小于10 mm視為低度敏感;大于10 mm小于15 mm視為中度敏感;大于15 mm視為高度敏感[26]。結果顯示,提取物對金黃色葡萄球菌具有強抑菌活性,抑菌圈直徑為(17.861±0.948) mm(如圖1B),高度敏感。

圖1 合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌抑菌活性實驗Fig.1 Antibacterial activity of Hepu pearl extracts against S. aureus注:A:合浦珍珠提取物凍干粉;B:合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈實驗,1:陰性對照;2～4:合浦珍珠提取物240.00 mg·mL-1。

2.2 合浦珍珠提取物最小抑菌濃度的測定

采用96孔法檢測合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度,結果顯示,37 ℃培養24 h后,空白組無細菌生長,其他各組均有細菌生長。通過組間單因素方差分析,與陰性對照組比較,0.94～240.00 mg·mL-1的合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌生長抑制具有極顯著性差異(F=34.909,P<0.01),最低抑菌濃度為0.94 mg·mL-1,且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果呈一定的劑量依賴關系(如表1)。

表1 合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度實驗Table 1 Experiment on the MIC of Hepu pearl extract on S. aureus

2.3 合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌生長影響

如圖2所示,在LB培養基中加入濃度為0.5×MIC的合浦珍珠提取物,金黃色葡萄球菌的生長基本不受影響,隨著提取物濃度的增大,對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用越明顯,且當添加的合浦珍珠提取物濃度≥2×MIC時,金黃色葡萄球菌的生長受到顯著(P<0.05)抑制,與陰性對照相比,其延緩期明顯延長。

圖2 合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌生長影響Fig.2 Effects of Hepu pearl extract on the growth of S. aureus

2.4 溫度對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖3 所示,以金黃色葡萄球菌的OD600值為指標探討提取物抑菌活性[27],-80～80 ℃處理30 min,與4 ℃處理組相比抑菌活性相對穩定,但與100 ℃處理30 min抑菌活性相比有所下降,大約為4 ℃的68%,但與對照組相比,所有處理組仍具有極顯著(P<0.01)的抑菌活性。表明合浦珍珠提取物表現出良好的熱穩定性。

圖3 不同溫度對合浦珍珠提取物抗菌活性的影響Fig.3 Effect of different temperature on the antibacterial activity of Hepu pearl extracts注:“**”表示與對照相比,P<0.01,差異極顯著;圖4～8相同。

2.5 反復凍融對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖4所示,-20 ℃反復凍融提取物1～6次,其抑菌活性與未凍融組相比無顯著變化,且與對照組相比,仍有顯著的抑菌活性。表明合浦珍珠提取物中抑菌活性物質在反復凍融的情況下仍具有穩定的抑菌活性。

圖4 反復凍融對合浦珍珠提取物抗菌活性的影響Fig.4 Effect of repeated freezing-thawing on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.6 pH對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖5所示,合浦珍珠提取物在pH3.0～9.0范圍內的抑菌活性保持穩定,但在pH11.0時略有下降,相比pH7.0提取物抑菌活性保留約70%,但總體上與對照相比菌仍有極顯著(P<0.01)抑菌活性。表明合浦珍珠提取物中的活性物質具有良好的酸堿穩定性,在強酸強堿條件下仍具有抑菌活性。

圖5 pH對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effect of pH on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.7 紫外線對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖6所示,合浦珍珠提取物經20 W紫外線處理5～30 min后,與未經紫外線處理組相比,抑菌活性無顯著變化。說明合浦珍珠提取物中的活性物質能夠對抗紫外線的破壞,保證其在自然環境中也能發揮較好的抑菌活性。

圖6 紫外線對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響Fig.6 Effect of ultraviolet ray on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.8 金屬離子對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖7所示,合浦珍珠提取物在25～200 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2條件下,抑菌活性基本不受影響,但在25～200 mmol·L-1MgCl2條件下,抑菌活性逐漸降低,在200 mmol·L-1MgCl2條件下時,抑菌活性相比未添加金屬離子組保留約40%;但與對照相比仍有顯著抑菌活性,分析可能是高濃度的Mg2+與提取物中的活性物質結合,對其結構有一定的影響,從而使其抗菌活性略有降低[28]。

圖7 金屬離子對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響Fig.7 Effects of metal ions on antibacterial activity of Hepu pearl extract

2.9 胰蛋白酶和胃蛋白酶對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響

如圖8所示,與未經處理的提取物組相比,胰蛋白酶處理1 h后的合浦珍珠提取物抑菌活性有所下降,相對抑菌活性保留約70%,但相比對照組仍有極顯著(P<0.01)抑菌活性;而經胃蛋白酶處理后的提取物,抑菌活性喪失。表明合浦珍珠提取物對胰蛋白酶具有一定的耐受性,但對胃蛋白酶較為敏感。

圖8 胰蛋白酶和胃蛋白酶對合浦珍珠提取物抑菌活性的影響Fig.8 Effect of trypsin and pepsin on antibacterial activity of Hepu pearl extract

3 結論

本研究采用超聲-酸-加熱聯合法制備合浦珍珠提取物,以金黃色葡萄球菌標準菌株為試驗菌,探討合浦珍珠提取物的體外抑菌活性及抑菌穩定性。牛津杯實驗表明合浦珍珠提取物對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性,最小抑菌濃度為0.94 mg·mL-1,且呈一定的劑量依賴效應;并且≥2×MIC的合浦珍珠提取物能顯著(P<0.05)抑制金黃色葡萄球菌的生長;合浦珍珠提取物表現出良好的抑菌穩定性,對溫度不敏感,耐酸堿,對紫外線和反復凍融和金屬離子其抑菌活性比較穩定,對胰蛋白酶穩定,但對胃蛋白酶比較敏感,總體上合浦珍珠提取物表現出了良好體外抑菌活性和穩定性。在后續研究中,課題組擬將結合體內實驗探討其抑菌作用和安全性評價,分析其對其他細菌、真菌的抑菌活性,后續將對提取物進行分離鑒定,獲得具體活性單體物質,從而為推廣合浦珍珠資源綜合利用和精深加工奠定一定基礎。