大孔樹脂純化桑白皮多糖的工藝研究

孫 偉,葉 潤,蔡 靜,谷清義,喬新榮

(信陽農林學院生物與制藥工程學院,河南信陽 464000)

桑白皮為雙子葉植物?？粕?MorusalbaL.)除去栓皮后的干燥根皮,別名桑根皮、桑根白皮、白桑皮、桑皮[1],主產于河南、安徽、浙江、湖南、江蘇等地,始載于《神農本草經》[2]?！吨袊幍洹酚涊d桑白皮性味甘寒,歸肺脾經,具有瀉肺平喘,行水消腫的功效,主治肺熱喘咳、尿少水腫、面目肌膚腫脹等癥[3]。桑白皮主治消渴尿多,且功效獨特,有記載桑白皮“是它藥不替也”[4]。 現代醫學研究發現,桑白皮具有抗菌[5-6]、抗炎[7]、利尿[8]、降糖[9]、抗HIV、鎮靜鎮痛[10]等作用。近年來研究發現其也具有抗氧化性,并對心腦血管疾病具有預防治療作用,對損傷的功能細胞也具有修復作用[11-13]。多糖作為桑白皮的主要成分之一,其含量與桑白皮的諸多藥理作用密不可分,但是目前對桑白皮多糖的研究還比較少,所以,研究桑白皮多糖的純化工藝具有一定應用價值和必要性。

大孔樹脂由于其獨特的多孔結構及材料性質,多應用于黃酮[14]、多酚[15]、多糖等[16-17]的分離純化。目前,利用大孔樹脂純化桑白皮多糖的研究尚未被報道,因此本實驗以10種不同型號大孔樹脂的分離、純化效果為研究目標,篩選出最佳的純化樹脂及最優的分離條件,為更高效的開發桑白皮和利用桑樹資源提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑白皮 2019年02月購于信陽美銳大藥房有限公司,并經信陽農林學院中藥教研室陳瓊教授鑒定;葡萄糖標準品 合肥博美生物科技有限責任公司;蒽酮 色譜純,上海展云化工有限公司;D-101、AB-8、DM301、DA-201、H103、NKA-9型大孔樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司;HP20、X-5、HPD-722、HPD300型大孔樹脂 山東魯抗立科藥物化學有限公司;濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇均 分析純,武漢市中天化工有限責任公司;所有實驗用水 均為二次重蒸水。

UV-1600紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司;ME104電子分析天平 瑞士梅特勒公司;HG101-3A電熱鼓風干燥箱 南京卓鼎干燥設備廠;400Y多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司);SCQ-168數控加熱超聲波清洗機 上海聲彥超聲波儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;DKZ-2B電熱恒溫振蕩水槽 上海精宏實驗設備有限公司;層析柱(30×300 mm) 江陰市新輝層析設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑白皮的預處理 將精選的桑白皮清洗后,置鼓風干燥箱60 ℃下干燥4 h至恒重,粉碎后過80目分樣篩,備用。

1.2.2 桑白皮多糖的粗提 取桑白皮粉200 g,置于2000 mL燒杯中,加入6倍量的蒸餾水,在50 ℃水浴中浸泡提取8 h,并于50 ℃下300 W超聲30 min,過濾得提取液。將提取液減壓蒸餾濃縮至粘稠狀,冷卻后加入95%的乙醇100 mL使糖類沉淀,4 ℃靜置2 h后過濾,反復2～3次,得濾渣冷凍干燥為桑白皮粗多糖,4 ℃保存備用[18]。

1.2.3 多糖含量的測定 采用蒽酮-硫酸法[19]測定桑白皮多糖純化前后的多糖含量。

1.2.4 大孔樹脂的處理 取十種不同型號的大孔樹脂,先用重蒸水洗滌,接著以3倍柱體積的95%乙醇浸泡24 h,再用重蒸水洗滌至無乙醇味;將處理好的大孔樹脂分別用3倍柱體積,質量濃度為6%的HCl和質量濃度為6%的NaOH溶液浸泡3 h,最后用重蒸水洗至中性[20-22]。

1.2.5 靜態吸附的吸附率和解析率考察 取處理過的十種不同型號的大孔樹脂各1 g,放入150 mL具塞錐形瓶中,再加入30 mL質量濃度為4.0 mg/mL桑白皮粗多糖水溶液,將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上振蕩24 h,取上清液,按照“1.2.3”項中方法處理測定A625值,計算上清液粗多糖的含量,計算吸附量(Q)及吸附率(P)。

Q(mg/g)=(C0-C1)V/m;

P(%)=[(C0-C1)/C0]×100

將吸附后的大孔樹脂過濾,重蒸水洗滌后,再加入質量分數85%的乙醇溶液50 mL,在同樣條件的搖床中進行解吸,取解吸液按照“1.2.3”項中方法處理測定A625值,計算解吸率(D)。

D(%)=[C2/(C0-C1)]×100

注:C0為粗多糖溶液中多糖的原始含量(mg/mL),C1為大孔樹脂吸附后溶液中多糖的含量(mg/mL),C2為解吸液中多糖的含量(mg/mL),V為粗多糖溶液體積(mL),m為大孔樹脂的質量(g)。

1.2.6 靜態吸附的動力學曲線 取處理過的D-101型大孔樹脂1 g,放入150 mL具塞錐形瓶中,再加入30 mL質量濃度為4.0 mg/mL桑白皮粗多糖水溶液,將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上振蕩吸附6 h,每0.5 h取1 mL溶液,測定吸光值,計算吸附率,繪制吸附曲線[23]。

1.2.7 D-101型大孔樹脂動態吸附中對吸附效果的影響條件考察

1.2.7.1 pH 取處理好的D-101型號大孔樹脂1.0 g,裝入Ф20 mm×200 mm的層析柱里,將1.2.2中的粗多糖配制成質量濃度為4.0 mg/mL溶液,用稀鹽酸分別調節pH=2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0,以2.0 BV/h(1 BV=45 mL)的速度上樣并靜置2 h,保持柱溫在25 ℃,每5 mL收集流出液,測定吸光值[24],計算大孔樹脂的吸附率。

1.2.7.2 上樣速度 按照以上確定的最佳條件,選用處理好的D-101型號大孔樹脂,將1.2.2中的粗多糖配制成質量濃度為4.0 mg/mL溶液,調節pH=3.0,分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h的速度上樣并靜置2 h,保持柱溫在25 ℃,每5 mL收集流出液,測定吸光值,計算大孔樹脂的吸附率。

1.2.7.3 上樣濃度 按照以上確定的最佳條件,選用處理好的D-101型號大孔樹脂,將1.2.2中的粗多糖分別配制成質量濃度為1.0、2.0、3.0、3.0、5.0、6.0 mg/mL溶液,調節pH=3.0,以2.0 BV/h的速度上樣并靜置2 h,保持柱溫在25 ℃,每5 mL收集流出液,測定吸光值,計算大孔樹脂的吸附率。

1.2.8 D-101型大孔樹脂動態吸附中對解吸效果的影響因素考察

1.2.8.1 洗脫劑濃度 將制備好的粗多糖配制成質量濃度為4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7確定的最佳條件上樣,依次用150 mL的25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液洗脫,洗脫速度在1.0 BV/h,分段收取洗脫液,測定吸光值,計算大孔樹脂的解吸率。

1.2.8.2 洗脫劑用量 將制備好的粗多糖配制成質量濃度為4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7確定的最佳條件上樣,用75%乙醇溶液洗脫,洗脫劑用量分別在2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 BV,洗脫速度在1.0 BV/h,分段收取洗脫液,測定吸光值,計算大孔樹脂的解吸率。

1.2.8.3 洗脫流速 將制備好的粗多糖配制成質量濃度為4.0 mg/mL溶液,按照1.2.7確定的最佳條件上樣,用75%乙醇溶液洗脫,用量在3.5 BV,控制洗脫速度分別在1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h,分段收取洗脫液,測定吸光值,計算大孔樹脂的解吸率。

1.3 數據處理

每組實驗平行做3次,結果采用平均值±標準差形式表示,單因素實驗采用SPSS 13.0軟件和Excel 2010軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 多糖含量測定的方法學考察

2.1.1 標準曲線的繪制 分別精密移取0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞試管中,加重蒸水至2.0 mL,再分別精密加入0.2%蒽酮-濃硫酸溶液5.0 mL,振蕩后置90 ℃水浴20 min后移出,冷卻后在625 nm波長下測其吸光度A值。以葡萄糖濃度(x)為橫坐標,吸光值(y)為縱坐標,作標準曲線。得線性回歸方程y=0.0921x+0.0642,相關系數r=0.9995,在0.0020～0.1600 mg/mL濃度區間內線性關系良好。

2.1.2 精密度測定 精密稱量0.0010 g桑白皮粗多糖,完全溶解后置于25 mL容量瓶中定容,搖勻。精密移取0.2 mL于具塞試管中,按照“2.1.1”項中方法處理測定A625值,得RSD為0.802%(n=6),說明儀器精密度良好。

2.1.3 重復性測定 準確稱量6份桑白皮粗多糖0.0100 g,按照“2.1.1”項中方法處理,得RSD為0.915%(n=6),說明該方法重復性良好。

2.1.4 穩定性測定 準確移取桑白皮粗多糖待測液0.4 mL于25 mL容量瓶中用重蒸水定容,按照“2.1.1”項中方法檢測,分別于0、15、30、45、60、75、90、105、120 min檢測吸光值,計算RSD值,得RSD為1.102%(n=9),說明桑白皮粗多糖待測液在2 h內穩定。

2.1.5 加樣回收率測定 準確移取6份0.4 mL桑白皮粗多糖待測液,分別精密加入0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液0.4 mL,按照“2.1.1”項中方法檢測,測定A625值,得平均回收率為98.04%,RSD為1.81%(n=6)。

2.2 大孔樹脂類型的篩選

根據“1.2.4”項中大孔樹脂的處理方法得十種不同型號的大孔樹脂吸附效果(見表1),H103、D-101、HPD300、AB-8這四種大孔樹脂的吸附量較高,但是 H103的解吸率最低,這可能與 H103的比表面積最大有關系;HPD300的吸附率最大,但是解吸率不足60%,這也可能與HPD300的比表面積比較大有關系;HPD-722、DA-201、D-101、AB-8這三種樹脂的比表面積適中,表現出良好的吸附、解吸性能,且D-101的綜合數值最優,故最終選取D-101型大孔樹脂為接下來實驗所使用的樹脂。

表1 十種不同型號的大孔樹脂吸附和解吸效果Table 1 Adsorption and desorption effects of ten different types of macroporous resins

2.3 靜態吸附的動力學曲線

如圖1所示,D-101型大孔樹脂對多糖的吸附在前3.0 h呈上升的趨勢,在3.0 h的時候達到吸附的最大值,之后基本達到飽和,吸附趨于穩定。

圖1 靜態吸附的動力學曲線Fig.1 Kinetic curve of static adsorption

2.4 D-101型大孔樹脂動態吸附中對吸附效果的影響條件考察

2.4.1 pH對吸附效果的影響 如圖2所示,當樣品的pH調節為3.0時上樣,此時D-101型大孔樹脂對多糖的吸附效果最好。pH過小或者過大都會阻礙大孔樹脂的吸附,主要因為酸堿度對多糖溶解度和化學性質影響較大[25],相對來說弱酸性條件下更容易被樹脂吸附,被洗脫劑解吸。故最終確定把樣品pH調節到3.0進行上樣。

圖2 pH對吸附效果的影響Fig.2 Effect of pH on adsorption efficiency

2.4.2 上樣速度對吸附效果的影響 如圖3所示,當上樣速度在2.0 BV/h時,D-101型大孔樹脂對多糖的吸附效果最佳。上樣速度太快會導致大孔樹脂來不及吸附,吸附率大幅度降低;上樣量太慢會影響整體的純化效率[26]。綜合各因素考慮,確定上樣速度在2.0 BV/h為最佳。

圖3 上樣速度對吸附效果的影響Fig.3 Effect of sample loading rate on adsorption efficiency

2.4.3 上樣濃度對吸附效果的影響 如圖4所示,當上樣濃度低于4.0 mg/mL 時,大孔吸附樹脂還有較多的吸附多糖的位點,因此吸附率會隨著濃度的增加而增大;但隨著濃度的進一步增加,溶液中的雜質含量也會越來越多,與桑白皮多糖成分競爭吸附樹脂的位點的作用也會越來越強[27],因此吸附率稍有下降。故最佳上樣液質量濃度為4.0 mg/mL。

圖4 上樣濃度對吸附效果的影響Fig.4 The effect of sample concentration on adsorption efficiency

2.5 D-101型大孔樹脂動態吸附中對解吸效果的影響因素考察

2.5.1 洗脫劑濃度對解吸效果的影響 如圖5所示,D-101型大孔樹脂的最佳洗脫濃度為75%的乙醇,濃度過大或者過小都不利于多糖的解吸,根據“相似相溶”原理,桑白皮乙醇提取物中多糖極性較大,低濃度的乙醇不能破壞樹脂與多糖形成的氫鍵,故解吸率較低。而高濃度乙醇會使極性與多糖極性相差變大[28],解吸率亦會降低,因此選用濃度為75%的乙醇作為解吸液。

圖5 洗脫劑濃度對解吸效果的影響Fig.5 The effect of eluent concentration on desorption efficiency

2.5.2 洗脫劑用量對解吸效果的影響 如圖6所示,低于3.5 BV時隨著洗脫劑用量的增加,解吸率逐漸增加;當洗脫劑用量大于3.5 BV時,解吸率隨洗脫劑用量的增加變化不明顯。從理論上講,洗脫劑的用量越多越能完全將吸附在樹脂上的多糖洗脫下來,但是過量的洗脫劑會增加成本和后續濃縮的工時。因此,綜合考慮解吸率、成本和工時,最佳洗脫劑用量為3.5 BV。

圖6 洗脫劑用量對解吸效果的影響Fig.6 Effect of eluent dosage on desorption efficiency

2.5.3 洗脫流速對解吸效果的影響 如圖7所示,隨著解吸液流速的增加,桑白皮多糖的解吸率呈下降的趨勢?？赡苁且驗榱魉俚募涌鞂е陆馕号c大孔樹脂不能充分接觸,不能使吸附在大孔樹脂上的桑白皮多糖成分被解吸出來,最佳洗脫流速為1.0 BV/h。

圖7 洗脫流速對解吸效果的影響Fig.7 Effect of elution flow rate on desorption efficiency

2.6 驗證純化試驗

按照以上確定的最優條件,用處理好的D-101型號大孔樹脂,將2.1.2中的粗多糖配制成質量濃度為4.0 mg/mL溶液,調節pH=3.0,以2.0 BV/h的速度上樣并靜置2 h,保持柱溫在25 ℃,用75%的乙醇溶液洗脫,洗脫劑用量分別在3.5 BV,洗脫速度在1.0 BV/h,收集洗脫液,測定吸光值,計算桑白皮多糖的純度,3次平行實驗結果如表2。經過D-101型大孔樹脂純化處理后,桑白皮多糖的純度從16.12%±1.20%提高到了74.45%±1.15%,可以看出在此工藝設置下,D-101大孔樹脂純化桑白皮多糖切實可行,可以獲得較高的純化效率。

3 結論

通過對10種大孔樹脂的吸附量、吸附率和解吸率進行研究比較,篩選出桑白皮多糖的最佳純化樹脂為D-101型大孔樹脂。再經過單因素試驗考察,得出最佳上樣條件為:pH=3.0、上樣速度為2.0 BV/h、上樣濃度為4.0 mg/mL;最佳洗脫條件為:75%的乙醇洗脫液、洗脫劑用量為3.5 BV、流速為1.0 BV/h。經過該工藝純化后,桑白皮多糖的純度從16.12%提高到了74.45%。該工藝根據方法學考察驗證穩定可行,為桑白皮中多糖的富集、純化提供了實驗依據,也為桑白皮、桑樹資源的有效開發利用提供了新的途徑,且大孔樹脂的成本低廉、操作簡單再生容易、效率高,可為大規模生產提供科學依據。