超聲輔助低共熔溶劑提取蘋果葉中的總黃酮

孔 方,李 莉,劉言娟

(臨沂大學,山東臨沂 276000)

中國是蘋果生產大國,產量約為4100多萬噸/年,約占全世界總產量的55%。與此同時,每年會產生大量的蘋果葉,但這些蘋果葉沒有被充分利用,大多被掩埋或者焚燒,不僅浪費了資源而且污染了環境。而蘋果葉的藥用價值早有記載,《滇南本草》記載:敷臍上治陰癥,又治產后血迷,經水不調,蒸熱發燒,服之神效;貼火毒瘡或湯火,燒灰調油搽之最良[1-2]。

已有研究報道,蘋果葉中含有很多黃酮類化合物[2-3]。該類化合物具有諸多生物活性,主要包括:抗氧化[4-5]、保護心血管系統[6]、增強免疫[7]、抗腫瘤[8]、降低血糖[9]、抗菌[10]、抗炎[11]、抗病毒[12]、抗過敏[13]等。該類化合物在醫藥、化妝品、保健品和食品等領域均有廣泛應用,是目前倍受關注的天然產物之一。對蘋果葉總黃酮進行提取,既能實現對廢棄資源的利用,也能更好地開發利用蘋果葉總黃酮。新型低共熔溶劑(DES)是一種由氫鍵受體和氫鍵供體按一定比例混合后于一定溫度下加熱攪拌形成的透明、均一、穩定的溶液[14]。具有蒸汽壓低、無毒性、可生物降解、溶解性和導電性優良、電化學穩定窗口寬等獨特的理化性質,并且DES是多元體系,可以任意組合,更容易選擇適合的組分,在很多領域有著廣泛的應用前景[15-19]。DES在溶解能力方面具有獨特的性質,可以有選擇的對無機或有機物進行溶解,因此,在天然產物提取分離方面具有很好的應用價值。DES已在液液萃取、固相微萃取、高效液相色譜、逆流色譜等領域有較多的應用[20-23]。

本研究首先篩選對蘋果葉總黃酮提取效果最佳的DES,研究超聲溫度、超聲時間等參數對提取效果得影響,在此基礎上,利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken設計實驗對提取工藝進行優化,確定超聲波輔助DES提取蘋果葉總黃酮的最佳工藝條件,以期為蘋果葉資源的充分利用提供一定的技術支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果葉 采自山東省淄博市沂源縣,洗凈,于60 ℃烘箱中干燥2 h,粉碎過60目篩,備用;氯化膽堿、對甲酚、三氟乙酸 分析純,阿拉丁試劑有限公司;丙三醇、乙二醇、三乙醇胺、95%乙醇 分析純,天津恒興化學制劑有限公司;蘆丁 純度98%,中國食品藥品檢定研究院。

KQ-250DB超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;TU-1810SPC紫外可見分光光度計 北京友儀四方科技有限公司;DF-1集熱式磁力攪拌器 江蘇金壇市金勝實驗儀器廠;SHK-III型循環水式多用真空泵 鄭州科泰實驗設備有限公司;AB104電子分析天平 鄭州南北儀器設備有限公司;DHG-9035A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海恒科技有限公司;ST-06型300 g多功能粉碎機 永康市帥通工具有限公司;JIDI-20D臺式高速離心機 廣州吉迪儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制及總黃酮得率的測定 精密稱取蘆丁對照品10 mg,置于50 mL容量瓶中,用70%的乙醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得蘆丁對照品溶液(0.2 mg/mL)。參照文獻[24-25]方法進行回歸方程、線性范圍和相關系數的考察,具體實驗過程如下:采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法,以蘆丁為對照品,于510 nm下測定吸光度A,以黃酮濃度C為橫坐標,所測吸光度為縱坐標,繪制黃酮標準曲線,得線性回歸方程、相關系數分別為:A=0.0127C-0.0016,R2=0.999。結果表明,蘆丁對照品溶液在0.008～0.048 mg/mL濃度范圍內呈現良好的線性關系。

參照文獻[24-25]方法進行得率測定,具體實驗過程如下:精密量取蘋果葉提取液1.5 mL置于25 mL容量瓶中,用去離子水補足至10 mL,加入1 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻放置6 min;再加入1 mL 10%的Al(NO3)3溶液,搖勻放置6 min;最后加入4%的NaOH溶液10 mL,用去離子水定容,搖勻放置15 min,以蘆丁為對照,于510 nm下測定吸光度,計算蘋果葉總黃酮得率,計算公式如下:

式中:C:樣品溶液測得吸光度所對應的標準曲線上的濃度,mg/mL;V1:樣品溶液顯色并定容后的體積,mL;V2:蘋果葉總黃酮提取液的總體積,mL;V3:測吸光度時所吸取樣品溶液的體積,即用于顯色的樣品溶液體積,mL;m:蘋果葉粉末質量,g。

1.2.2 蘋果葉總黃酮的提取 稱取一定量的蘋果葉粉末,按一定的液料比向其中加入具有一定含水量的DES,于超聲波萃取儀中在超聲功率為120 W時,按照一定的超聲溫度,超聲一段時間。待蘋果葉提取液冷卻至室溫后,在6000 r/min轉速下離心10 min,棄去蘋果葉殘渣,按上述條件重復離心兩次,收集上清液,即得蘋果葉總黃酮提取液。

1.2.3 DES的優化

1.2.3.1 DES的制備 將氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/丙三醇、氯化膽堿/三氟乙酸、氯化膽堿/對甲酚、氯化膽堿/三乙醇胺分別按摩爾比1∶2混合于圓底燒瓶中,在80 ℃油浴鍋中攪拌1.5 h,直至形成透明均一的液體,所得產物即為DES。

1.2.3.2 DES組成體系的選擇 固定提取劑與蘋果葉粉末的液料比30∶1 mL/g、DES含水量10%、超聲溫度70 ℃、超聲功率120 W和超聲時間30 min,改變DES種類對蘋果葉進行超聲提取,提取液用“1.2.1”項下的方法進行含量測定,確定最優DES組成。

1.2.3.3 DES含水量的選擇 利用“1.2.3.2”中篩選出的最優DES,配制成DES含水量分別為0、10%、20%、30%、40%和50%的提取溶劑,固定液料比30∶1 mL/g、超聲溫度70 ℃、超聲功率120 W和超聲時間30 min,對蘋果葉進行超聲提取,提取液用“1.2.1”項下的方法進行含量測定,確定提取效果最佳時的DES含水量。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 液料比對蘋果葉總黃酮得率的影響 以氯化膽堿和三氟乙酸摩爾比1∶2制備DES,調節其含水量為30%,蘋果葉粉末與DES提取溶劑的液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1 mL/g,在超聲功率為120 W,超聲溫度為70 ℃下超聲提取30 min,計算蘋果葉總黃酮得率,考察液料比對蘋果葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.2 超聲溫度對蘋果葉總黃酮得率的影響 以氯化膽堿和三氟乙酸摩爾比1∶2制備DES,調節其含水量為30%,按蘋果葉粉末與DES提取溶劑的液料比為20∶1 mL/g,超聲功率為120 W,在超聲溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃下超聲提取30 min,計算蘋果葉總黃酮得率,考察超聲溫度對蘋果葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.3 超聲時間對蘋果葉總黃酮得率的影響 以氯化膽堿和三氟乙酸摩爾比1∶2制備DES,調節其含水量為30%,蘋果葉粉末與DES提取溶劑的液料比為20∶1 mL/g,在超聲功率為120 W,超聲溫度為70 ℃條件下,分別超聲提取10、15、20、30、40和50 min,計算蘋果葉總黃酮得率,考察超聲時間對蘋果葉總黃酮得率的影響。

1.2.5 BBD設計試驗 根據單因素實驗的結果,以液料比(X1)、超聲溫度(X2)、超聲時間(X3)3個因素作為變量,利用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件,以-1、0、1代表變量水平,進行BBD設計3因素3水平實驗方案,獨立變量的真實值與編碼水平見下表1。

表1 BBD設計的因素水平Table 1 Factor level of BBD design

本實驗選擇3因素3水平的BBD結合響應面對試驗參數進行進一步優化,以此來考察液料比(X1)、超聲溫度(X2)、超聲時間(X3)3個因素不同水平組合下對黃酮得率的影響?？傸S酮得率的二階多元回歸方程如下式所示:

式中,Xi,Xj表示獨立的變量,Y表示響應變量,β0表示常數,βi表示一次項系數,βii表示二次項系數,βij表示交互項常數。

1.3 數據處理

所有實驗平均進行3次。本研究利用Origin 8.5軟件進行做圖,采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken對數據進行方差顯著性處理和分析,所有實驗數據全部以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 DES的確定

2.1.1 DES種類對蘋果葉總黃酮得率的影響 提取溶劑對得率有很大的影響作用。不同溶劑因理化性質不同,提取所用時間以及所得得率也不同,因此選擇合適的溶劑有利于有效成分的高效提取。本研究比較了5種DES對蘋果葉總黃酮的提取效果,結果如下圖1所示。

圖1 DES種類對蘋果葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of DES on the yield of total flavonoids from apple leaves注:1為氯化膽堿/乙二醇;2為氯化膽堿/丙三醇;3為氯化膽堿/三氟乙酸;4為氯化膽堿/對甲酚;5為氯化膽堿/三乙醇胺。

由圖1可知,由氯化膽堿/三氟乙酸制備的DES對蘋果葉總黃酮的得率最高,可達4.8%。這可能是由于氯化膽堿/三氟乙酸制備的DES具有較低的粘度,擴散系數比較大,流動性好,對細胞壁具有更好的滲透性,從而能實現對蘋果葉總黃酮較好的提取效果。由氯化膽堿/乙二醇和氯化膽堿/丙三醇制備的DES粘度較大,對細胞壁的滲透性較差,所以對目標物的提取效果不理想。有研究表明,酚對位取代基的推電子性能夠增強由氯化膽堿/酚所制備DES的氫鍵相互作用,從而導致體系的密度、黏度增加[26],因此,氯化膽堿/對甲酚DES的密度和粘度均較高,擴散性和流動性均較差,從而對細胞壁的滲透性不好,對目標物的提取效果差。本研究推測由氯化膽堿/三乙醇胺制備的DES可能由于自身組成和結構的原因導致其與目標物之間的作用力很弱,故對目標物的提取效果最差。因此,本研究選用氯化膽堿/三氟乙酸制備的DES進行后續實驗。

2.1.2 DES含水量對蘋果葉總黃酮得率的影響 DES可與水互溶,水可以改變DES的張力、極性和粘度等性質。一定的含水量能降低DES的粘度,同時由于水的加入使得被提取物質膨脹,使提取溶劑更容易滲透到植物細胞內部增大溶劑與被提取物質的接觸面積,從而使其對目標物的提取更有利。

本研究改變DES含水量,考察其對總黃酮得率的影響,結果如下圖2所示。由圖2可知,隨著DES含水量的增大,蘋果葉總黃酮得率呈現先升高后下降的趨勢,在含水量為30%時得率最高。這是由于含水量在一定范圍內增大時可降低DES粘度,使其更有利于滲透進細胞,所以得率隨之上升。達到最大值以后,含水量繼續增加使得組成DES的兩個組分濃度過低,兩者之間不能形成氫鍵進而打破了DES體系,溶劑的理化性質被大大改變,越來越接近水的性質,使得率明顯下降,因此本實驗選取含水量為30%的氯化膽堿/三氟乙酸作為提取溶劑進行后續實驗。

圖2 DES含水量對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of DES water content on yield of total flavonoids

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 液料比對蘋果葉總黃酮得率的影響 實驗結果如圖3所示,在液料比小于20∶1時,蘋果葉總黃酮得率隨液料比的增大而呈上升趨勢,20∶1時蘋果葉總黃酮得率最大,之后開始下降。推測溶劑量的增加使物料與溶劑接觸面積、溶液傳質推動力均增大,濃度梯度變大,有利于黃酮的溶出,從而使其溶出速度和得率變大;而當溶劑增加過多時,大量溶劑的存在會消耗超聲波的能量,使超聲的效率下降,不能有效的擊穿細胞,使有效物質的釋放減少,造成黃酮得率下降。因此,本研究選擇20∶1 mL/g為最佳液料比。

圖3 液料比對蘋果葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids from apple leaves

2.2.2 超聲溫度對蘋果葉總黃酮得率的影響 實驗結果如下圖4所示,在小于70 ℃的區間內,蘋果葉總黃酮得率隨溫度的升高而增大,在70 ℃時,黃酮得率達到最大值,再繼續升高溫度時黃酮得率開始下降。隨著溫度的升高,一方面會使DES的粘度降低,另外DES的能量也增加,促進溶劑進入組織細胞,加速有效成分的釋放;當達到適宜值后,溫度升高得率反而下降,這是由于溫度過高會使黃酮類成分結構發生破壞,從而使得率有所下降。因此,選擇超聲溫度為70 ℃進行后續實驗。

圖4 超聲溫度對蘋果葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound temperature on the yield of total flavonoids from apple leaves

2.2.3 超聲時間對蘋果葉總黃酮得率的影響 實驗結果如下圖5所示,隨著超聲時間的延長,黃酮得率逐漸增大,以30 min為分界點,大于30 min后黃酮得率反而隨著時間的延長而降低。出現該現象的原因可能是:時間延長,植物組織中的有效成分不斷溶出,得率增加,到一定時間時,得率達到最高;提取時間繼續延長,得率開始下降,這是因為長時間提取時,非黃酮類物質溶出增加,并且長時間超聲可能會導致已溶出的黃酮類化合物發生分解。另外,超聲時間越長造成的能耗越大,使提取成本大幅度增加,本研究選擇30 min為最佳超聲時間。

圖5 超聲時間對蘋果葉總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasound time on yield of total flavonoids from apple leaves

2.3 超聲輔助DES提取蘋果葉總黃酮的工藝優化

2.3.1 BBD與響應面試驗結果 響應面試驗設計及結果見表2,方差分析見表3。

表2 響應曲面設計試驗與結果Table 2 Response surface design experiments and results

表3 響應曲面二次模擬方差分析Table 3 Response simulation surface quadratic simulation analysis of variance

利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結果進行回歸擬合,得到總黃酮得率(Y)對以上3個因素的二次多項回歸模型:

2.3.2 響應曲面分析 響應曲面的陡峭程度及等高線形狀反映兩因素交互作用的顯著程度,曲面越陡峭,等高線越接近橢圓,則兩因素交互作用對響應值的影響顯著;陡峭程度越小,等高線越近于圓形,則表示兩因素交互作用對響應值無顯著性影響,各因素之間的交互影響直觀效果如下圖6～圖11所示。

如圖6～圖7所示,響應曲面相對平緩,等高線接近于圓形,說明提取溫度和液料比的交互作用對響應值的影響不顯著。黃酮得率隨提取溫度和液料比的遞增先增加后減少,提取溫度對總黃酮得率的影響大于液料比的影響。

圖6 液料比-超聲溫度兩因素交互作用對總黃酮得率影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound temperature interaction on the yield of total flavonoids

圖7 液料比-超聲溫度兩因素交互作用對總黃酮得率影響的等高線圖Fig.7 Contour map of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound temperature interaction on the yield of total flavonoids

如圖8～圖9所示,曲面陡峭,等高線形狀接近橢圓,說明超聲時間和液料比的交互作用對響應值的影響顯著,曲面坡度說明液料比對于蘋果葉總黃酮得率的影響大于超聲時間。

圖8 液料比-超聲時間兩因素交互作用對總黃酮得率影響的響應面圖Fig.8 Response surface diagram of the effect of liquid and solid ratio and ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

圖9 液料比-超聲時間兩因素交互作用對總黃酮得率影響的等高線圖Fig.9 Contour map of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound time two-factor interaction on the yield of total flavonoids

如圖10～圖11所示,曲面陡峭,等高線形狀近似橢圓,說明超聲溫度和超聲時間的交互作用對響應值的影響顯著,且曲面坡度表明超聲溫度對于蘋果葉總黃酮提取率的影響大于超聲時間的影響。

圖10 超聲溫度-超聲時間兩因素交互作用對總黃酮得率影響的響應面圖Fig.10 Response surface diagram of the effect of ultrasound temperature and ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

圖11 超聲溫度-超聲時間兩因素交互作用對總黃酮得率影響的等高線圖Fig.11 Contour map of the effect of ultrasound temperature-ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

2.3.3 最佳工藝條件的確定 通過Design-Expert 8.0.6軟件,依據數學回歸模型對數據進行優化,得出最佳工藝參數為液料比22.84∶1 mL/g,超聲溫度為72.14 ℃,超聲時間為26.53 min,預測總黃酮得率為7.23%。

為驗證分析結果的可行性與可靠性,選取液料比23∶1 mL/g,超聲溫度72 ℃,超聲時間27 min,進行驗證實驗,蘋果葉總黃酮得率為7.06%,實際得率與預測得率相差2.35%,二者非常接近,表明該優化條件準確可靠。

3 討論

本研究以DES為提取溶劑對廢棄蘋果葉中的總黃酮進行超聲輔助提取,確定了提取效果最佳的DES為氯化膽堿/三氟乙酸,最佳含水量為30%。響應面結果表明,超聲輔助提取蘋果葉總黃酮的最佳工藝條件為:液料比23∶1 mL/g、超聲溫度72 ℃、超聲時間27 min,按照該工藝進行提取,蘋果葉總黃酮的平均得率為7.06%。研究結果表明,具有一定含水量的DES對黃酮類化合物具有較好的溶出效果,可將其應用于黃酮及其他天然產物的提取中。超聲輔助DES提取蘋果葉總黃酮具有操作簡單、成本低、綠色環保等特點,本研究能為廢棄蘋果葉的開發利用提供一定的技術支撐和理論依據。