雜色蛤酶解物的降糖活性初步評價及其物質基礎研究

,3,3,*,3,*

(1.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發重點實驗室,江蘇南京 210023;2.南京中醫藥大學江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心,江蘇南京 210023;3.南京中醫藥大學藥學院,江蘇南京 210023)

雜色蛤[Ruditapesphilippinarum(Adams et Reeve)]是一種分布廣泛的藥食兩用海洋生物,蛤蜊肉性咸、寒,歸胃、肝、膀胱經[1]。宋《嘉佑本草》記載,蛤蜊肉“潤五臟,止消渴,開胃解酒毒”[2]。研究表明,蛤蜊肉的主要成分為多糖類、蛋白質肽類、核苷類、氨基酸類等[3-4]。蛤蜊肉經水提醇沉得到的粗多糖部分,可降低四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠的血糖、血清胰島素和甘油三酯水平,具有較好的降血糖作用[5-6]。

近年來,相關研究陸續發現食物來源的降糖活性多肽[7-8],如牛奶[9]、牡蠣[10]、苦瓜等[11-12]。二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制肽作為重要的一類降糖活性肽受到廣泛關注。胰升血糖素樣肽-1(GLP-1)作為內源性的腦腸肽,可通過多種途徑降低血糖,體內DPP-IV可分解GLP-1使其失活,而DPP-IV抑制肽可通過減少GLP-1降解失活發揮降低血糖的作用[13],食物來源的DPP-IV抑制肽成為近年來健康產品研究的方向之一[14]。課題組前期從雜色蛤的木瓜蛋白酶酶解產物中分離純化獲得4個具有DPP-IV抑制活性的多肽[15]。這些食物來源的生物活性肽具有生物相容性好、安全性高、抑制活性確切等特點[16]。

本文以雜色蛤蛋白質為研究對象[17],通過生物酶水解獲得活性多肽類成分,以體外DPP-IV抑制活性評價及HepG-2胰島素抵抗模型尋找確定降糖活性部分,采用Nano LC-MS/MS技術分析活性肽類組成,以明確雜色蛤降糖活性肽類物質基礎,從而促進江蘇特色貝類資源的充分開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雜色蛤軟體 江蘇省海洋水產所提供,批號201606;HepG-2細胞 中科院上海細胞庫;酸性蛋白酶(50000 U/g)、鹽酸羅格列酮 北京索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;棕櫚酸 日本東京化成工業株式會社;高糖培養基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)、低糖DMEM、雙抗(Penicilin-Streptomycin,PS)、胰酶 美國Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 美國Gibco公司;葡萄糖測定試劑盒(GOD-POD法) 上海榮盛生物藥業有限公司;1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液 翼飛雪生物科技有限公司;DPP-IV美國Bio Legend公司;甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺(Gly-Pro-PNA)、抑二肽素A(Diprotin A,Ile-Pro-Ile) 美國Sigma公司;超純水 實驗室自制;其余試劑 均為分析純。

BT 125D型電子分析天平 德國Sartorious有限公司;FA2004型電子分析天平 上海上平儀器有限公司;R-210旋轉蒸發儀 德國BUCHI公司;SHZ-Ⅲ循環水式真空泵 南京科爾儀器設備有限公司;冷凍干燥器 美國Labconco公司;MP512-01型精密pH計 上海三信儀表廠;MO-AOR型培養箱 美國Major Science公司;Elix Essential5水純化系統 美國Merck Millipore公司;BB 150二氧化碳培養箱、ST16R臺式低溫高速離心機 美國Thermo scientific公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州凈化設備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雜色蛤酶解肽制備工藝流程 工藝流程圖如圖1所示。

圖1 雜色蛤多肽樣品制備流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of peptide sample from Ruditapes philippinarum

1.2.2 雜色蛤不同酶解時間樣品的制備 取雜色蛤軟體200 g,充分瀝干,加入3倍量水充分勻漿處理后,以1 mol/L鹽酸調節pH至3.0,平均分為6份,置于下述條件下利用酸性蛋白酶進行酶解:50 ℃,酶底比(E/S)4%,酶解0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h,酶解結束后,在100 ℃條件下加熱滅酶10 min,冷卻至室溫,離心(5000 r/min,25 ℃)10 min后收集上清,加入乙醇至終濃度為60%,醇沉12 h,離心(5000 r/min,25 ℃)10 min,收集上清,50 ℃旋轉濃縮,濃縮至原體積的1/5,冷凍干燥后,得到不同酶解時間的酶解樣品,對其體外DPP-IV抑制活性及胰島素抵抗細胞葡萄糖攝取量進行測定。

1.2.3 雜色蛤不同極性酶解樣品的制備 取酶解樣品600 mg,用超純水(含0.1%TFA)復溶,采用Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱進行分離,上樣后,分別用超純水、5%、10%、20%、80%乙腈(均含0.1%TFA)進行洗脫,收集不同濃度乙腈洗脫液,分別得到不同乙腈洗脫部分,凍干,以上樣品均保存于-20 ℃。

1.2.4 DPP-IV抑制活性評價方法

1.2.4.1 主要溶液的配制 Tris-HCl緩沖溶液配制:Tris-HCl緩沖溶液濃度15 mmol/L,pH8.8,以下簡稱緩沖液。

DPP-IV、底物Gly-Pro-PNA和陽性藥Ile-Pro-Ile配制:取Gly-Pro-PNA粉末約6.64 mg,加入緩沖液配制成濃度為3.2 mmol/L底物溶液;取Ile-Pro-Ile粉末約5 mg,加入緩沖液配制成0.3 mmol/L陽性藥溶液;DPP-IV(0.2 mg/mL),加入緩沖液配制成0.1 μg/mL DPP-IV溶液。

1.2.4.2 活性評價 在96孔板中分別加入雜色蛤不同時間酶解樣品溶液25 μL、不同極性洗脫樣品溶液25 μL、陽性藥Ile-Pro-Ile25 μL,再各自加入25 μL底物Gly-Pro-PNA,放入孵育箱37 ℃緩慢振搖10 min充分混合均勻,加入50 μL DPP-IV溶液,此時各樣品終濃度為1.25 mg/mL,啟動反應,于37 ℃繼續孵育1 h,反應結束后迅速加入100 μL 1 mmol/L醋酸鈉水溶液終止實驗并于405 nm下測量吸光度[18],抑制率計算公式如下:

1.2.5 HepG-2胰島素抵抗模型評價方法

以往的SEC儲量評估工作，在評估單元的增減變化上均以采油廠為限，建立SEC評估單元、建立經濟評估參數以采油廠為限；以采油廠（或油公司）為界限提交技術與經濟資料已經有數年之久，且經過了不斷地調整與完善，為采油廠全面參與SEC儲量評估打下了基礎。

1.2.5.1 樣品溶液配制 取不同酶解時間樣品和不同濃度乙腈洗脫部分樣品的凍干粉末約10 mg,加入單一培養基(高糖DMEM,以下簡稱單培)分別配制成10 mg/mL樣品溶液,經0.22 μm微孔有機濾膜過濾除菌,-20 ℃保存備用。

1.2.5.2 細胞活性評價 HepG-2細胞接種于完全培養基(高糖DMEM含10% FBS,以下簡稱全培),于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞生長至90%融合時,棄去原培養基,使用PBS洗滌,加入0.25%胰酶,37 ℃消化90 s,消化完成后,于1000 r/min,4 ℃離心5 min。棄去上清,加入全培將細胞沉淀吹打均勻,按2×105cell/mL細胞密度,每孔100 μL接種到96孔板,孵育24 h后,吸去原培養基,開始給藥。

將細胞分為空白組、模型組、陽性對照組、給藥組;空白和模型組加入180 μL單培,陽性和給藥組加入160 μL單培后各加入20 μL 0.2 mg/mL的鹽酸羅格列酮溶液和20 μL樣品溶液,于孵育箱中孵育30 min后,除空白組加入20 μL全培外,其余各組加入20 μL 1 mg/mL棕櫚酸誘導液,誘導24 h后,將各組細胞內培養液更換為新鮮低糖DMEM繼續孵育12 h后,采用GOD-POD微量法測剩余葡萄糖濃度,在505 nm下測量剩余葡萄糖含量,利用標準品吸光度(OD)值,計算葡萄糖消耗量[19-20]。

1.2.6 Nano-LC MS/MS分析

1.2.6.1 多肽分析 色譜條件:戴安U3000 nano RSLC納升液相系統,Reprosil C18AQ色譜柱(75 μm×150 mm,5 μm);上樣量5 μL;流速400 nL/min;流動相A為乙腈-甲酸-水溶液(2∶0.2∶98,V/V),B為乙腈-甲酸-水溶液(80∶0.2∶20,V/V);線性梯度洗脫:2%～30% B,140 min[21]。

質譜條件:選用 Thermo Q-Exactive Orbitrap MS質譜儀進行肽段分析,噴霧電壓2.5 kV,離子傳輸毛細管溫度200 ℃;質譜一級全掃描范圍為m/z 100～2000,分離寬度為3 Da;串聯質譜分析首先獲得總離子色譜圖(TIC),通過碰撞誘導解離(CID)將雙電荷離子碎裂,并產生一系列二級質譜MS/MS譜。

1.2.6.2 數據庫比對 串聯質譜數據采用MaxQuant軟件進行搜庫分析鑒定,選擇軟體動物門數據庫(Mollusca,2019年7月下載于 www.uniprot.org);檢索參數:前體離子誤差20 ppm,子離子誤差0.2 Da;Deamidation(N,Q),允許2個位點誤切,假陽性率(FDA)≤1%;酶切方式:unspecific;其他為默認參數[22],在上述檢索條件下所得分值有顯著性意義(P<0.05),被認定為有效的鑒定結果。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同酶解時間樣品活性評價結果

如圖2A所示,與其它酶解時間樣品相比,在終濃度為2.5 mg/mL時,酶解1 h樣品具有更好的DPP-IV抑制活性,抑制率可達63.13%±3.50%,抑制率顯著高于其余各組(P<0.05);圖2B顯示,在終濃度為1 mg/mL時,不同酶解時間樣品對于棕櫚酸誘導的HepG-2胰島素抵抗模型均具有極顯著的促進葡萄糖消耗的作用(P<0.01),除酶解5 h樣品效果相較其他組較差之外(P<0.05),其余各組之間沒有明顯差異,葡萄糖的消耗量均處于36%左右。綜合兩種評價模型結果,酶解1 h樣品活性最佳,故選酶解1 h樣品進行后續分離研究。

圖2 不同酶解時間樣品(A)DPP-IV抑制率和(B)葡萄糖消耗量Fig.2 DPP-IV inhibition rate(A)and glucose consumption of samples from different enzymatic time注：圖A中*表示1 h樣品組與其他樣品組差異顯著P<0.05；圖B中，與模型組相比，##表示差異極顯著P<0.01；不同小寫字母表示0.5～5 h樣品組差異顯著P<0.05。

2.2 不同洗脫部位活性評價結果

對于酶解1 h樣品的不同濃度乙腈洗脫部分的DPP-IV抑制活性評價如圖3所示,在終濃度為1.25 mg/mL的情況下,10%乙腈洗脫部分具有最佳抑制活性,且極顯著高于其余三組(P<0.01),抑制率為43.12%±2.01%(圖3A)。在促進細胞葡萄糖攝取方面,給藥濃度為1 mg/mL的情況下,相較于其他樣品組及模型組,10%乙腈洗脫部分能夠明顯提升細胞葡萄糖消耗量,此時10%乙腈洗脫部分葡萄糖消耗量為38.50%±3.14%(圖3B),效應優于其他部分(P<0.01)。綜合以上結果,對10%乙腈洗脫部分進行成分分析鑒定。

圖3 不同濃度乙腈洗脫樣品DPP-IV抑制率(A)和葡萄糖消耗量(B)Fig.3 DPP-IV inhibition rate(A)and glucose consumption of samples eluted with different concentrations of acetonitrile注：**表示10%樣品組與其他樣品組差異極顯著P<0.01；圖B中，與模型組相比，##表示差異極顯著P<0.01。

2.3 Nano-LC MS/MS分析

采用Nano-LC MS/MS對10%乙腈洗脫部分進行多肽成分分析鑒定,結合MaxQuant搜庫軟件共鑒定出114種多肽,并確定了相應序列,已知質譜數據和數據庫中的數據越吻合所得分數(Score)越高[23],本文列出了得分最高的前20種多肽為例(表1),經鑒定這些肽段主要來自肌球蛋白、肌動蛋白、微管蛋白、組蛋白等。

表1 得分最高的前20種多肽Table 1 Top 20 peptides with the highest score

以肽段YALPHAIL為例,該肽段[M+H]2+m/z 1719.825,MS/MS(圖4A)顯示其主要碎片離子有b7+(766.4246)、b6+(653.3406)、b5+(582.3035)、b3+(348.1918)、b2+(235.1077)、y1+(132.1019)、y2+(245.186)、y3+(316.2231)、y4+(453.282)、y5+(550.3348)、y6+(663.4188)、y7+(734.4559),經搜庫可確定該肽段來自肌動蛋白,具體位置見圖4B。綜合信息顯示,質譜數據與數據庫吻合,確定肽段的氨基酸序列為YALPHAIL。

圖4 YALPHAIL的MS/MS(A)及YALPHAIL在肌動蛋白中的位置(B)Fig.4 MS/MS(A)and location in Actin(B)of YALPHAIL

共統計到114個肽段中每種氨基酸殘基的出現頻次(圖5C),其中親水性氨基酸為822個,疏水性氨基酸為641個;數量最多前5種氨基酸分別是:親水性氨基酸賴氨酸(Lys,119個)、精氨酸(Arg,112個)、谷氨酸(Glu,106個)和疏水性氨基酸亮氨酸(Leu,120個)、異亮氨酸(Ile,111個)?？傮w而言,親水性氨基酸數量多于疏水性氨基酸數量,比例接近1.3∶1。結合親水平均值(GRAVY)來評估肽段的親水性和疏水性(圖5A),GRAVY值低于0顯示為親水性,結果顯示在鑒定出的多肽中,83.3%為親水性多肽,但其中25%的肽段N端具有2個疏水氨基酸,85%的肽段N端至少含有1個疏水氨基酸,研究證明位于肽段N-末端側的兩個氨基酸的疏水性與肽的DPP-IV抑制效力正相關[24-25],由此可見,10%乙腈洗脫部位具有發掘高DPP-IV抑制肽的潛力。對多肽分子量分布情況進行統計(圖5B),發現所鑒定的多肽分子量(MW)主要分布在811.38～2658.40 Da,其中90.4%的肽分子量低于2000 Da,研究發現二肽,三肽或10～20個氨基酸組成的短肽易被人體完整吸收而發揮生物活性[26-27],表明所鑒定出的這些低分子量的短肽具有穿過膜屏障而發揮生物效應的可能。

圖5 肽的鑒定Fig.5 The identified peptide注:A:親水平均值(GRAVY)指數值;B:鑒定的肽的分子量(MW)分布;C:鑒定的肽中所有氨基酸的出現頻率;1～19分別表示：丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸；所有的值都基于肽的總數。

3 結論

本文使用兩種模型:DPP-IV體外抑制模型和HepG-2棕櫚酸誘導的IR模型,前者是DPP-IV能夠剪切去除底物Gly-Pro-PNA氨基末端第2個氨基酸為脯氨酸(Pro),使PNA游離顯色[28],最終以顯色的吸光度值比較DPP-IV的被抑制效果;選擇后者的原因主要是因為糖尿病患者產生胰島素抵抗的原因是不盡相同的,棕櫚酸長時間作用使細胞產生胰島素抵抗[29],是目前廣泛使用的體外胰島素抵抗模型,造模簡便快捷,效果明顯。

本實驗發現雜色蛤酶解產物的10%乙腈洗脫部分具有最佳的抑制DPP-IV,增加細胞葡萄糖攝取作用,經質譜鑒定發現10%乙腈洗脫部分含有的一系列分子量較低的肽段,其中83.3%為親水性多肽,與洗脫極性相對應。但DPP-IV 抑制肽通常含有較高比例的疏水性氨基酸,疏水性氨基酸可能會加強與DPP-IV的S1疏水口袋的作用,肽段N-末端側的前兩個氨基酸的疏水性與多肽的DPP-IV抑制效力呈正相關[24-25],10%乙腈洗脫部分中85%的肽段N-末端側的前兩個氨基酸中至少含有1個疏水氨基酸,結果表明,10%乙腈洗脫部分的DPP-IV的抑制作用與其N-末端的疏水氨基酸相關。

另外,通過前期兩種評價模型數據可以看到,10%乙腈洗脫部分確實在兩種模型中均表現出最佳的活性,表明10%乙腈洗脫部分是兩者模型的活性重合部位,10%乙腈洗脫部分可能通過DPP-IV相關途徑發揮降糖作用,這將在后續實驗中對這一假設進行驗證。

后續可對10%乙腈洗脫部分進行進一步的分離純化,得到單一或多個肽段,結合分子對接技術[30]研究對DPP-IV的抑制作用影響,并聯系細胞實驗與在體實驗,將對10%乙腈洗脫部分的降糖作用機理進行深入研究,驗證蛤蜊酶解肽的DPP-IV抑制作用及其發揮降糖功效之間的聯系。