懷菊轉錄組中SSR位點信息分析

邢冰 董誠明 魏碩

摘要：以轉錄組測序數據為基礎，利用MISA軟件對簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）進行檢測及分析，分析懷菊轉錄組中的SSR位點信息，并設計SSR引物，為后期SSR標記的開發和物種遺傳多樣性檢測等提供參考。結果表明，共檢測到8 553個SSR位點，它們分布在 7 369 條Unigene中，出現頻率為2.83%，SSR位點的發生頻率為2.44%;其中單核苷酸重復基序最多、其次為三核苷酸重復基序。懷菊轉錄組基序長度主要集中于 12～19 bp，多具有中等多態性。對SSR序列設計引物，共得到25 662對引物可供今后使用?？傊?，懷菊SSR位點類型豐富，具有良好的多態性潛力及可開發性。

關鍵詞：懷菊;SSR;位點信息;轉錄組

中圖分類號： S567.23+9.01 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0057-04

收稿日期：2019-09-20

基金項目：2016年度中央引導地方科技發展專項資金“河南道地大宗藥材種質評價及集約化種植與示范”。

作者簡介：邢 冰（1995—），女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事藥用植物研究。E-mail：xingbingywz@163.com。

通信作者：董誠明，教授，主要從事藥用植物研究。E-mail：dcm371@hactcm.edu.cn。 ?懷菊為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥頭狀花序[1]，栽培及藥用歷史悠久，研究表明，經過長期的自然環境改變和人工干預，懷菊種質可能發生了變異與分化，品質下降[2]。目前關于懷菊的研究主要集中于人工栽培、組織培養、質量評價等方面，對于其種質資源和分子標記輔助育種的研究尚少[3-6]。因此，對于懷菊品種鑒別及遺傳多樣性的研究具有重要意義。

簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）是指由1～6個核苷酸為重復單位組成的簡單串聯重復序列。簡單重復序列能反映出物種間高度的等位基因多樣性，不同物種的重復次數、基序類型、長度等差異很大，由此開發的SSR分子標記技術具有操作簡便、穩定性好、多態性高等優點，已經在品種純度鑒定、基因功能研究、遺傳多樣性分析等方面有廣泛的應用[7-8]。轉錄組測序技術可開發大量的SSR標記，且速度快、成本較低[9]，能夠克服傳統SSR分子標記技術的弊端。本研究基于高通量測序結果，獲得大量懷菊轉錄組序列信息，并對轉錄組數據中的SSR位點進行檢測，分析其分布及結構特點，以期為懷菊種質資源鑒定、遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構建等提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗中的轉錄組測序樣本懷菊來源于河南省焦作市溫縣，種植于河南中醫藥大學藥用植物園溫室，采集后于河南中醫藥大學組織培養實驗室進行離體培養得到懷菊愈傷組織、芽叢、幼苗。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測、文庫構建與測序 將樣品送至北京百邁客生物科技有限公司提取mRNA，分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，檢測合格后，進行文庫構建，分別使用Qubit 2.0和Aglient 2100方法對文庫的濃度和插入片段大小進行檢測，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格后，利用Illumina HiSeqTM 2000 高通量測序平臺對其進行轉錄組測序。

1.2.2 懷菊轉錄組SSR的篩選 采用MISA軟件對組裝出來的Unigene序列進行SSR檢測、篩選。各重復次數搜索標準如下：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復次數至少分別為10、6、5、5、5、5次。對不同SSR類型在基因轉錄本的密度分布進行統計。同時篩選被間隔≤100 bp 堿基間隔的復合型SSR。

1.2.3 懷菊SSR引物設計 使用Primer 3.0（235 版，默認參數）軟件進行SSR引物設計，并針對預測到的每一個SSR位點分別設計3組引物供后期試驗選擇。主要的引物參數設置：退火溫度（Tm）在57～63 ℃，上、下游引物Tm值相差小于 5 ℃;擴增產物大小為100～280 bp，引物長度為 10～27 bp;GC含量小于60%。

2 結果與分析

2.1 懷菊轉錄組測序結果

懷菊高通量測序后總計產出 83.67 GB 數據，干凈讀序經Trinity組裝后最終獲得302 379條Unigene，過濾后發現，質量不低于30的堿基比例（Q30，測序錯誤率 < 1%）為90.92%，表明測序結果良好，可對獲得的數據進行進一步分析。

2.2 懷菊SSR數量與分布

采用MISA軟件對Unigene進行SSR檢測，共檢出 8 553 個SSR位點，它們分布在7 369條Unigene中，其中有4 477條Unigene含單個SSR位點，有 2 553 條Unigene含2個及2個以上SSR位點。SSR發生頻率為2.44%，出現頻率為2.83%，平均每 10 kb 有1.27個SSR位點（表1）。

2.3 懷菊轉錄組中SSR基元類型和比例

對SSR類型進行統計發現，二核苷酸至六核苷酸重復類型均有出現，不同核苷酸基序種類及重復次數差異明顯。在考慮到堿基互補配對原則的情況下，單核苷酸重復單元有4種，占60.77%，多數重復次數為10～22次，主要為A/T基序重復，而 C/G 基序出現頻率較低;二核苷酸重復單元有12種，占14.40%，多數重復次數為6～10次，重復次數最多的基序是TG，其次是TA;三核苷酸重復單元有63種，占19.17%，多數重復次數為5～7次，重復次數最多的基序為TGA，其次是ATC;四核苷酸重復單元有48種，占0.83%，重復次數最多的基序為TAAA，其次是TTAT;五、六核苷酸重復單元分別有9、3種，分別占0.11%、0.04%，重復次數最多的基序分別是GGGGA與TTGATA（表2）。

2.4 懷菊SSR基元長度分布及其多態性

究篩選出的懷菊SSR長度均≥10 bp，其中12～19 bp 的SSR有4 279個（占比為50.03%），具有中等多態性;而≥20 bp的SSR有621個（占比為726%），具有較高的多態性。此外，研究發現，高級基元SSR的多態性普遍比低級基元的低[10]。本研究中，低級基元單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸共占總SSR的9434%，而在長度≥20 bp的SSR中共有138個，占長度≥20bp的所有SSR的22.22%，表明大部分懷菊轉錄組SSR具有高多態性潛能（圖1）。

2.5 懷菊SSR引物設計

為了篩選出可在試驗中應用的懷菊SSR，使用Primer 3.0軟件對含有SSR位點且SSR上下游序列

均不小于150 bp的unigene進行引物設計。結果根據SSR位點信息，批量設計了25 662對引物（部分引物見表3）。

3 討論與結論

近年來，通過轉錄組測序技術開發分子標記已成為一種主要的方式。Han等基于轉錄組測序結果對野菊花SSR分子標記進行開發，并對其遺傳分化等方面開展系統研究[11]。Kobeissi等使用SSR標記評估菊花遺傳多樣性，以利于種質資源保護和遺傳育種[12]。張運興等利用MISA軟件對SSR位點進行搜索，并開發系列引物，為菊花種質資源和遺傳多樣性分析提供依據[13]。從本研究的結果來看，首先進行全基因組測序，再分析SSR信息，不僅可以得到更多的信息，準確性也大大提高。然而，由于不同品種的菊花之間基因組差異巨大，僅參考菊花基因組序列，并不能系統地對懷菊進行分析。本研究針對懷菊基因組進行初步組裝，并進行SSR分析及引物設計，這有利于懷菊的種質鑒定，同時也對懷菊的遺傳分析具有重要意義。

懷菊轉錄組測序后共獲得302 379條Unigene，利用MISA軟件進行搜索，共發現8 553個SSR位點，其中以單核苷酸和三核苷酸重復為主，占SSR總數的79.94%。張運興等的研究表明，菊花中以三核苷酸重復類型出現頻率最高[13]，而本研究發現，懷菊中的單核苷酸最多，可能是由于不同植物SSR的主導重復基元類型有所不同[14-15]，范三紅等認為，可能是由于這種重復基元編碼相應蛋白質的出現率較高[16]。同時，樣品、測序技術的不同，研究中檢測及評價方法的不同，也可能會造成同類型物種的SSR信息出現一定的差異。本研究發現，A/T、TGA/ATC分別是懷菊中單核苷酸和三核苷酸SSR類型的優勢重復基元。有研究表明，單核苷酸中A/T重復的數量居多，而雙子葉植物中三核苷酸主要重復類型是AAG/CTT[17]。張華麗等的研究表明，在萬壽菊三核苷酸SSR類型中出現次數最多的重復基元是ATC/ATG[18]。初步分析這一差異可能與懷菊的SSR特性和物種的差異有關。SSR長度是影響其多態性高低的重要因素[19]，本研究發現，懷菊中長度大于12 bp的SSR共有4 900個，占總數的57.29%，具有中等以上的多態性，可以重點利用這類SSR進行懷菊分子標記的開發及遺傳多樣性等方面的研究。

綜上所述，通過檢測懷菊轉錄組序列中SSR信息，得到數量多、可用性強的SSR位點， 對于加速懷菊SSR標記的開發、種質鑒定及遺傳性狀分析等研究具有重要意義。

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