外泌體長鏈非編碼RNA：腫瘤分子診斷新型標志物*

常文婧 綜述，李 冬，孫祖俊 審校

(同濟大學附屬同濟醫院檢驗科，上海 200065)

外泌體是直徑為50～200 nm，由脂質雙層膜包裹的納米級細胞外囊泡，廣泛存在于血液、尿液、淋巴液、精液、乳汁、唾液等體液中。外泌體可作為載體攜帶蛋白質、核酸[DNA、mRNA、miRNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)等]和脂類等物質，可通過直接的膜融合作用、內吞作用、吞噬作用和配體/受體的相互作用將其相關成分轉移到靶細胞，從而發揮相應的生物學功能[1]。近年來研究表明，lncRNA可被外泌體攜帶，廣泛參與細胞間物質交換與信號轉導并穩定地存在于體液中，且不受內源性RNA酶對其降解的影響[2]。深入分析外泌體lncRNA在腫瘤中的臨床應用，將為腫瘤的早期診斷、治療監測和預后評估等提供新的生物標志物。

1 外泌體lncRNA概述

lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，缺乏完整的開放閱讀框，不具有編碼蛋白能力，或編碼功能受限。lncRNA可調控基因組在轉錄、轉錄后、表觀遺傳學方面的表達，參與染色質修飾，轉錄激活與抑制，基因組印記修飾，核內運輸，mRNA剪切和降解等調控過程，并與多種疾病，尤其是腫瘤的發生、發展、治療等密切相關[3]。目前，已有大量研究結果證明，病理狀態下，尤其是腫瘤疾病，許多外泌體lncRNA與正常對照樣本中的表達水平具有明顯差異，這說明外泌體能夠選擇性地包裝、分泌和轉移特定lncRNA，并發揮相應的生物學功能[2]。外泌體lncRNA研究是腫瘤生物學的重要部分，可參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、血管生成等環節，在藥物抵抗和免疫抑制微環境等方面也具有重要作用[2]。外泌體lncRNA可來源于腫瘤細胞、腫瘤相關巨噬細胞和成纖維細胞，通過惡性細胞和非轉化細胞間的信號傳遞作用于特定靶細胞，改變腫瘤微環境，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移；另外，外泌體lncRNA被證明可調節抗原呈遞，影響免疫細胞的活性，并誘導相關效應細胞的凋亡[4]。由于外泌體lncRNA的上述特性，目前普遍認為其可作為腫瘤早期診斷、療效監測和預后評估的新型生物標志物。

2 外泌體lncRNA的臨床應用

目前，臨床上常用的腫瘤生物標志物主要是腫瘤抗原和異位激素，雖然傳統生物標志物在腫瘤早期診斷中的應用比較廣泛，但其存在諸多不足，包括靈敏度低、特異性差，且同一種生物標志物可能預示多種癌癥風險，存在較大的漏診和誤診概率。因此，尋找敏感、特異、無創的腫瘤生物標志物，對腫瘤的早期診斷、治療監測和預后評估等均具有重要意義。近年來，隨著液體活檢的深入研究，發現外泌體lncRNA是最有潛力的液體活檢生物標志物之一。通過分析癌原性外泌體攜帶的lncRNA，可以直接獲取更多腫瘤學信息，協助腫瘤的早期診斷、治療監測和預后評估等[5]。

2.1外泌體lncRNA在神經系統腫瘤診斷中的應用 神經膠質瘤和膠質母細胞瘤是神經系統最常見的腫瘤，研究顯示，外泌體lncRNA在神經系統腫瘤診斷中具有潛在應用價值[6-8]。王博等[6]通過對82例神經膠質瘤患者和80例健康對照者血漿外泌體lncRNA LINC00511的表達進行檢測，發現其在神經膠質瘤患者血漿外泌體中表達上調，并與臨床特征及預后密切相關。另外，有研究發現，血清外泌體中的lncRNA HOTAIR和SBF2-AS1可作為膠質母細胞瘤診斷和預后評估的生物標志物[7-8]，見表1。

表1 外泌體lncRNA在神經系統腫瘤診斷中的應用

2.2外泌體lncRNA在消化系統腫瘤診斷中的應用 消化系統腫瘤主要包括胃癌、膽囊癌、肝癌、結直腸癌和胰腺癌，其發病率和病死率均較高。ZHAO等[9]通過檢測126例胃癌患者和120例健康對照者血清外泌體lncRNA HOTTIP的表達水平，結果發現，胃癌患者組表達水平明顯高于健康對照組，并與腫瘤浸潤和TNM分期顯著相關，對胃癌的診斷效能明顯高于血清學標志物[癌胚抗原、糖類抗原(CA)19-9和CA72-4]，是胃癌預后的獨立危險因子。因此，外泌體lncRNA HOTTIP是胃癌診斷和預后評估的潛在生物標志物。XU等[10]通過檢測60例肝癌、85例肝硬化、96例慢性乙型肝炎患者和60例健康對照者血清ENSG00000258332.1和LINC00635的表達水平，發現肝癌患者血清中兩種lncRNAs表達水平均明顯高于其他組，且與門靜脈栓塞、淋巴結轉移、TNM分期和總生存期相關；通過一項獨立隊列研究發現，ENSG00000258332.1、LINC00635與甲胎蛋白聯合診斷肝癌具有更高的靈敏度與特異度[10]。HU等[11]采用微陣列分析了50例結直腸癌患者和50例健康對照者血漿外泌體lncRNA表達譜，并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測表達水平，結果表明，患者血漿中有6種lncRNAs (LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV_108266、LNCV6_84003、LNCV6_98602)的表達水平較健康個體明顯上調，可能成為結直腸癌早期診斷的生物標志物。GE等[12]通過對膽管癌患者膽汁外泌體lncRNAs測序、GO分析、KEGG pathway和共表達分析，以及ROC曲線和生存分析發現，與對照組比較，ENST00000588480.1和ENST00000517758.1表達水平明顯增加，二者具有成為診斷標志物和治療靶點的潛在應用價值。任瀟凡等[13]通過檢測66例胰腺癌患者及66例健康對照者血清中外泌體lncRNA CCAT1表達水平，發現該lncRNA在胰腺癌患者外泌體中高表達，在胰腺癌的早期診斷中比CA19-9具有更高的靈敏度、特異度和準確性，并且與TNM分期和患者生存期有關，可作為預測胰腺癌患者不良預后的獨立因素。綜上所述，外泌體lncRNA在消化系統各類常見腫瘤，如胃癌、結直腸癌、肝癌等腫瘤患者中的表達水平與正常對照者比較有明顯差異，具有作為疾病診斷、預后評估等生物標志物的潛能，見表2。

表2 外泌體lncRNA在消化系統腫瘤診斷中的應用

2.3外泌體lncRNA在生殖系統腫瘤診斷中的應用 近幾年女性生殖系統腫瘤發病率急劇上升，并呈年輕化趨勢，嚴重威脅女性的健康。研究表明，外泌體lncRNA可作為卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌的早期診斷和預后評估標志物[40-44]。QIU等[40]研究發現，lncRNA MALAT-1在卵巢癌患者血清外泌體中呈高表達，且與腫瘤的進展和轉移高度相關，是卵巢癌總生存期的獨立預測因子。TANG等[41]研究發現，卵巢癌患者血清外泌體中aHIF表達水平升高，Kaplan-Meier生存分析顯示，血清外泌體aHIF表達水平較高的患者總體生存率較差。因此，aHIF被認為是卵巢癌不良預后的獨立因素。ZHANG等[42]通過定量檢測宮頸癌患者和健康對照者陰道灌洗液中外泌體lncRNAs HOTAIR、MALAT-1和MEG3表達水平，發現與正常對照者相比，3種lncRNAs富集于宮頸癌患者外泌體中，可作為宮頸癌診斷的生物標志物。ZHONG等[43]通過qRT-PCR檢測H19在乳腺癌患者及健康對照者血清外泌體中的表達水平，發現其在乳腺癌患者中表達水平明顯上調，患者術后H19的中位表達水平明顯低于術前；此外，外泌體H19表達水平與轉移、TNM分期相關，是一種新的乳腺癌診斷標志物。WANG等[44]的研究表明，血漿外泌體lnc RNA HOTAIR的表達與腫瘤組織中受體酪氨酸激酶ErbB2的表達呈正相關，可為開發新的液體活檢生物標志物和提高乳腺癌靶向治療效果提供分子基礎。見表3。

2.4外泌體lncRNA在泌尿系統腫瘤診斷中的應用 泌尿系統腫瘤主要包括前列腺癌、膀胱癌、腎癌、尿路上皮癌、陰莖癌、睪丸癌等。大量研究表明，血液或尿液中外泌體lncRNA是一種便捷、無創的泌尿系統腫瘤早期診斷及預后評估的新型標志物[45-53]。ISIN等[45]通過比較30例前列腺癌患者和49例良性前列腺增生患者尿液外泌體lncRNA-p21和GAS5的表達水平，觀察到前列腺癌和前列腺增生患者的外泌體lncRNA-p21表達水平有明顯差異，而GAS5表達水平無明顯差異，表明外泌體lncRNA-p21可作為評估前列腺癌患者惡性狀態的標志物。研究人員通過RNA測序來鑒定尿路上皮細胞癌患者尿液中富集的lncRNA，結果表明，尿液來源的lncRNA可作為生物標志物和治療靶點[46]。WANG等[46]的研究發現，與健康對照者及膀胱良性疾病患者相比，外泌體lncRNA H19富集于膀胱癌患者血清外泌體中，生存曲線分析顯示，膀胱癌患者血清外泌體H19水平越高，預后越差，認為血清外泌體H19可作為判斷膀胱癌患者預后的標志物。QU等[47]研究發現，lncRNA ARSR可作為外泌體的一部分被傳遞給舒尼替尼敏感的腎癌細胞，導致舒尼替尼耐藥，可作為腎癌預測耐藥的指標和潛在的治療靶點。多種lncRNA參與前列腺癌和膀胱癌的發生和發展，并可在尿液和血液中被檢出，可作為診斷、預后評估和預測耐藥的標志物。見表4。

2.5外泌體lncRNA在呼吸系統腫瘤診斷中的應用 肺癌是發病率和病死率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。研究表明，外泌體lncRNA對肺癌的早期診斷具有重要臨床意義。ZANG等[54]通過qRT-PCR檢測非小細胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織、血清和血清外泌體中UFC1的表達水平，發現NSCLC患者腫瘤組織、血清、血清外泌體中UFC1表達水平均上調，且高水平的UFC1與腫瘤浸潤有關，認為UFC1是診斷NSCLC的潛在標志物。TAO等[55]對NSCLC患者和健康對照者的血清外泌體lncRNA進行定量分析，發現SOX2OT、TBILA和AGAP2-AS1表達水平明顯上調，其中TBILA和AGAP2-AS1對早期NSCLC患者具有更好的診斷效率，且這兩種外泌體lncRNAs與臨床廣泛應用的血清腫瘤生物標志物(CA21-1)聯合使用，能夠進一步提高NSCLC患者診斷的準確性。LI等[56]對64例NSCLC患者和40例健康者進行血清外泌體GAS5定量分析，結果表明，與健康對照組相比，NSCLC患者GAS5表達水平下調，此外，其低表達與腫瘤體積及TNM分期相關。因此，GAS5可作為NSCLC早期診斷的標志物。ZHANG等[57]研究發現，外泌體MALAT-1在NSCLC患者中呈高表達，尤其是外泌體MALAT-1的表達水平與腫瘤分期和淋巴轉移均呈正相關，可作為NSCLC診斷和預后評估的液體活檢標志物。見表5。

表3 外泌體lncRNA在生殖系統腫瘤診斷中的應用

表4 外泌體lncRNA在泌尿系統腫瘤診斷中的應用

表5 外泌體lncRNA在NSCLC診斷中的應用

3 外泌體lncRNA檢測面臨的挑戰

在外泌體lncRNA的研究中，制備高純度外泌體是后續試驗中至關重要的一步，是試驗結果可靠的基礎。已有多種方法和技術可用于外泌體的分離、鑒定及lncRNA的檢測，但研究人員也面臨一系列重大挑戰。目前，外泌體lncRNA檢測面臨的挑戰主要表現在以下幾個方面：(1)雖然現在不斷推出新的外泌體提取試劑盒，操作步驟也越來越簡便、快速，但總體來說獲得的產物純度依然較低，現有的外泌體提取方法仍存在一定的缺陷，缺乏統一規范的標準化操作步驟，造成各實驗室之間檢測結果差異較大，因此，暫不適合于臨床大規模開展；(2)qRT-PCR檢測lncRNA應用廣泛，為驗證的金標準，可定量，操作簡便，成本低廉，但受到低通量的局限性；(3)RNA微陣列芯片檢測lncRNA具有高通量的優勢，但成本高、數據處理復雜；(4)RNA測序技術具有高通量的優勢，但不能滿足檢測單個基因的要求，檢測成本較高；(5)lncRNA的內參基因不統一，目前無法確定選取何種基因作為內參是穩定的，以及如何用合適的內參基因來計算循環lncRNA的表達。另外，對于外泌體lncRNA在腫瘤發生和發展中的作用及機制研究有待深入探索，選取作為生物標志物的外泌體lncRNA應具有檢測的高靈敏度和強特異度，在體液中的豐度應較高，而目前研究發現的一些lncRNAs，如H19、HOTAIR、MALAT-1等在多種腫瘤中呈高表達，其作為診斷標志物的特異度有待進一步提升，并且還應保證lncRNA在外泌體內穩定存在，必要時還要驗證其穩定性，滿足臨床檢測的要求。人體腫瘤細胞和正常細胞都能分泌外泌體，但是目前尚無特異性的標志物來區分外泌體的來源，因此，如何避免正常細胞分泌的外泌體產生的干擾，分離腫瘤特異性外泌體也是面臨的一大挑戰。

4 總結與展望

病理活檢作為傳統腫瘤診斷的金標準具有一定局限性，活檢取材對患者有創，具有一定的危險性，包括出血、腫瘤播散等，也不利于重復檢測和縱向監測；另外，病理活檢取材范圍局限，只能留取病變部位的一小塊組織，而腫瘤病變具有異質性，因此，不利于準確、全面地掌握疾病信息。近年來，外泌體lncRNA作為一種無創傷、特異和敏感的腫瘤標志物越來越受到人們的重視。外泌體lncRNA檢測多采用血清或血漿標本進行液體活檢，具有無創、可重復檢測、實時監測等優勢，聯合影像學資料及傳統的腫瘤標志物檢測，有望實現對腫瘤的早期診斷、復發監測、預后判斷和療效評估。目前，外泌體的分離提取、鑒定及lncRNA檢測技術尚需不斷優化，建立統一規范的標準化操作程序，對推動外泌體檢測在臨床上的應用具有重要意義?？紤]到外泌體的來源是異質性的，分泌到腫瘤中的外泌體具有多種亞型，外泌體亞型及外泌體對lncRNA的選擇性包裝、分泌和轉移機制都需要深入探索，以確保未來臨床應用的準確性。目前，外泌體lncRNA檢測技術還存在一定的局限性，那么對現有技術的改進及新技術的開發與應用就十分有必要。網絡數字模型、生物傳感器、人工智能等技術的聯合應用，將為外泌體lncRNA檢測技術帶來一場新的革命。隨著外泌體lncRNA的基礎理論和應用研究的不斷深入，外泌體lncRNA除了作為疾病早期診斷、治療監測和預后評估等生物標志物外，還可作為腫瘤的治療靶點，為腫瘤的精準診療提供一個新的方向。因此，外泌體lncRNA在腫瘤診療領域將具有廣闊的應用前景。