廣西地區葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的分子流行病學分析*

俸詩瀚，耿國興，陽 奇，黃麗梅，李孟婷，易 升，韋 媛，藍月云，歐陽魯平△

(1.廣西壯族自治區婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，廣西南寧 530003；2.廣西醫科大學第二附屬醫院遺傳與基因組醫學中心，廣西南寧 530007)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥在我國分布的特點主要呈“南高北低”，以廣西、廣東、海南、貴州、云南、四川等地區最為普遍，當前調查研究稱廣西地區的攜帶率大約為7.4%，而有個別省份的人群基因攜帶率接近16.0%[1-3]。當前用于檢測G6PD缺乏癥的方法較多,而WHO推薦的G6PD/6PGD比值法因其具有操作簡單、結果可靠性高及可檢出雜合子的優點，目前為國際公認的檢測方法[4-6]。G6PD缺乏的致病基因主要位于X染色體長臂2區8帶,依照X連鎖不完全顯性的遺傳方式，基因全長20 114 bp,主要由13個外顯子和12個內含子共同組成,可編碼515個氨基酸[7]。本研究對廣西地區457例疑似G6PD缺乏癥患兒同時進行G6PD/6PGD比值法酶活性檢測和基因突變檢測，以此判斷結果的吻合情況和廣西地區基因攜帶情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016-2017年來廣西壯族自治區婦幼保健院門診就診的疑似G6PD缺乏患兒及新生兒疾病篩查G6PD酶活性初篩陽性的新生兒共457例作為研究對象,其中G6PD缺乏癥患兒431例。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 LWC200i全自動生化分析儀;Lab-Aid核酸自動提取儀;BIO-RADC1000 PCR 基因擴增儀;ABI3500基因測序儀。

1.2.2試劑盒 廣州米基醫療器械有限公司改良版G6PD測定試劑盒(定量比值法)；致善生物科技公司Lab-Aid基因組DNA分離試劑盒;康為試劑公司2*ES Tap Master Mix試劑盒;DNA測序：引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通過一代基因測序技術Sanger法對DNA片段進行測序分析。

1.3研究方法

1.3.1方法 采集靜脈抗凝血，按照試劑說明書操作。結果判斷：G6PD/6PGD比值法G6PD酶活性缺乏<1.0(正常值1.0～2.5)。

1.3.2DNA提取 DNA提取參照致善生物科技公司Lab-Aid基因組DNA分離試劑盒的提取方法。

1.3.3基因突變檢測 設計G6PD引物，根據NCBI序列，利用Oligo7設計引物，擴增產物200～650 bp，其中E3-4、E5-6、E9-10、E11-12合并擴增。PCR擴增體系為25 μL，2×Master Mix 12.5 μL，上、下游引物0.5 μL，DNA溶液2 μL，水9.5 μL。擴增結束后，取3 μLPCR產物在 1% 瓊脂糖凝膠上電泳，100 V，40 min；電泳結束后取下用凝膠成像儀成像檢測，鑒定為本研究所需DNA片段后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析處理。

2 結 果

在門診隨訪的457例疑似患兒均采用G6PD/6PGD比值法進行酶活性檢測，其中G6PD/6PGD<1.0,即酶活性降低391例，G6PD/6PGD≥1.0～2.5，即酶活性正常66例。G6PD基因檢測，酶活性降低的391例疑似患兒均為G6PD基因致病突變攜帶者；而在酶活性正常的66例疑似患兒中，也檢測到40例攜帶有雜合致病性突變的患兒,均為女性。本研究中G6PD基因突變分布情況：95 A>G 74例(17.17%)，871 G>A 32例(7.42%)，1 024 C>T 28例(6.50%)，1 376 G>T 123例(28.54%)，1 388 G>A 156例(36.19%)，其余位點突變18例(4.18%)，見表1。兩種方法檢測457例G6PD疑似患兒檢出率見表2。

表1 431例G6PD缺乏癥患兒基因位點統計

表2 兩種方法檢測457例G6PD疑似患兒檢出率比較

3 討 論

G6PD缺乏癥是依據伴性不完全顯性遺傳,一般男性發病率較高,這是因為男性(核型46，XY)只有1條X染色體,當這條X染色體攜帶上G6PD缺乏癥的致病基因時,其酶活性明顯缺乏,稱為半合子;而女性(核型46，XX)不同，因其具有2條X染色體,其中某1條X染色體攜帶有G6PD缺乏癥的致病基因,但是剩下的另1條X染色體正常,可造成體內形成兩類紅細胞的“嵌合體”,稱為雜合子，這類女性攜帶者則稱為G6PD缺乏癥基因攜帶者,攜帶者的酶活性變化范圍較大,有些人可表現為正常,有些人則表現為半合子水平狀態;當女性2條X染色體都攜帶上G6PD缺乏癥致病基因時,就可稱其為純合子,其酶活性一般表現為中度或重度缺乏。純合子雖然不常見,但是依然可以發病[8]。

本研究發現，在457例(男305例，女152例)疑似患兒中，G6PD/6PGD比值法檢測出陽性391例，男292例(95.74%)，女99例(65.13%)，Sanger法檢測檢出陽性431例,男292例(95.74%)，女139例(91.45%)。G6PD/6PGD比值法檢出的391例酶活性異常疑似患兒結果與基因突變檢測結果相符，見表2，均可找到基因突變位點；而在酶活性正常的66例疑似患兒中，也發現致病性雜合突變攜帶者40例，均為女性，這部分患兒均數±標準差為1.19±0.16，可見G6PD/6PGD比值法測定只是一種表型診斷，會因為各種因素漏診一部分雜合子女性[9-10]。因此，當女性G6PD常規篩查檢測結果正常，但仍出現G6PD缺乏的臨床癥狀時，建議做基因突變檢測，以進一步確診是否攜帶G6PD致病基因。

G6PD變異有明顯的群體或地域方面的特異性，一般表現為某個群體或部族主要以某一種或幾種突變類型為主，如地中海沿岸國家多以563 C>T為主，非洲國家則多為202 G>A/c.376 A>G，而老撾、柬埔寨等東南亞國家基本上是以871 G>A/c.1 311 C>T為主，印度尼西亞的安汶人群多數為383 T>C，以上這些突變可能是較古老的突變。1 388 G>A、1 376 G>T和95 A>G是我國排前3的G6PD基因突變類型，目前這3類突變頻率之和占所有類型的70%以上，且僅在華人中存在[11-12]。在本次基因檢測發現，廣西地區熱點突變為：95 A>G 74例(17.17%)，871 G>A32例(7.42%)，1 024 C>T 28例(6.50%)，1 376 G>T 123例(28.54%)，1 388 G>A 156例(36.19%)，其余位點突變18例(4.18%)。1 388 G>A、1 376 G>T和95 A>G最為常見，其次是871 G>A，約占7.42%，該突變位點是泰國、越南、老撾、柬埔寨等東南亞國家的主要突變類型，有很高的發生率，我國其他地方也少有871 G>A的報道[13-15]。

通過G6PD/6PGD比值法與Sanger法基因突變檢測結果對比分析顯示，G6PD/6PGD比值法酶活性降低的疑似患兒與Sanger法基因突變檢測結果吻合率為100%，而酶活性正常的疑似患兒與基因突變檢測結果吻合率只有40%，這些未檢測出的患兒均為女性攜帶者，歸因于G6PD為伴X遺傳，存在隨機失活現象，出現部分雜合子突變患兒比值法酶活性高于切值，但仍攜帶有致病性突變。因此，采用分子診斷方法可有效檢測出女性雜合子。

綜上所述，廣西地區G6PD基因突變類型既有中國人群普遍代表性，又有廣西本地區人群G6PD基因突變的特征?；蚍肿铀綑z測明顯提高了女性雜合子G6PD缺乏癥的檢出率，解決了女性雜合子G6PD缺乏癥漏檢情況發生。