CRISPR/Cas9基因編輯技術介導SST基因敲除細胞的制備

王紫君,任紅艷,肖紅衛,華再東,畢延震

(湖北省農業科學院 畜牧獸醫研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430064)

CRISPR/Cas體系最初在細菌體內被發現,CRISPR是規律間隔性成簇短回文重復序列的簡稱,Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRIPSR/Cas體系普遍存在于細菌中,它是由RNA介導的可遺傳的獲得性免疫系統,可使細菌高效辨認和切割入侵的外源核酸[1]。CRISPR系統可分為6種類型,其中Ⅱ型系統僅需要1種Cas蛋白即可對外源核酸進行更高效、特異的切割,因此成為基因編輯工具的最佳選擇[2-3]。CRISPR/Cas技術作為第三代基因組編輯技術在近年迅速發展起來,目前該技術被成功應用于人類細胞、斑馬魚、小鼠、猴、豬、山羊等的基因組精確修飾[4-9]；通過對基因的修復機制包括非同源末端連接修復、同源重組修復等,由于CRISPR/Cas突變效率高、制作簡單及成本低的特點,被認為是一種具有廣闊應用前景的基因組定點改造工具[10]。

生長抑素(somatostatin, SST)是一種生長抑制激素,最初由Brazen等于1973年從動物下丘腦中發現[11],主要有14和28個氨基酸兩種活性形式,目前在豬、綿羊、大鼠、小鼠、牛等許多種屬動物體內發現多種SST樣的肽。研究發現,SST廣泛分布于中樞和外周神經系統以及胃腸道內,還存在于人甲狀腺的濾泡旁細胞、胎盤和腎臟、腎上腺髓質等部位。SST作用的發揮是通過膜上生長抑素受體(SSTR)介導,SSTR通過G蛋白與腺苷酸環化酶、鉀離子通道、鈣離子通道相偶聯,作用于細胞內相應的效應系統。SST通過抑制生長激素、促甲狀腺激素、胰島素、胰高血糖素、胃泌素和膽囊收縮素等的合成或作用效能,影響消化功能,抑制消化系統對營養物質的吸收,從而影響動物的生長[12]。

本實驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術定點敲除豬的SST基因,為在細胞水平、胚胎水平研究SST基因提供試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬成纖維細胞由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所動物胚胎工程與分子育種重點實驗室提供;載體質粒為pSpCas9(BB)-2A-Puro;感受態細胞DH5α購自武漢轉導生物實驗室有限公司。

1.2 主要試劑

FBS; DMEM basic(1×)、DPBS basic(1×)、Genomic DNA Mini Kit、Agarose購自Thermo Fisher Scientific;無內毒素質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司; pMDTM18-T Vector Cloning Kit、Premix Taq購自Takara;除特別說明,其他試劑均購自Sigma公司;本實驗所有引物均由生工武漢合成部合成。

1.3 用貼壁法分離豬腎的成纖維細胞

取1頭新生1～3 d的雄性大白豬,經腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg)深度麻醉;用75%酒精充分清洗消毒大白豬的體表,然后用滅菌醫用手術器械無菌操作取出雙側腎臟,置于75%酒精中浸泡并移至超凈工作臺內。

用含2%抗生素(青霉素132 mg/L、鏈霉素200 mg/L)的DPBS反復清洗腎臟,然后用手術剪仔細剝離腎臟包膜,再用75%酒精浸泡大約30 s以充分消毒避免污染。用DPBS清洗2次后將腎臟組織放入直徑為60 mm的細胞培養皿中,用眼科剪將其剪成大小約為 1 mm3的小塊組織。

將小塊組織分散到六孔板中,每孔約9塊組織,并盡量吸干組織周圍的液體。在恒溫培養箱中倒置4 h；待組織塊與培養皿底部緊密粘連時,取出加入500 μL培養基,培養基中含15%血清和1%雙抗。在39 ℃、5%CO2細胞培養溫箱中培養24 h后,加入2 mL完全培養基。每天觀察細胞的形態和生長狀態,根據細胞的狀態進行換液,預防細胞受到污染。

1.4 豬SST基因sgRNA的設計

選定豬SST基因(GenBank登陸號: NC_010455.5)的第一外顯子為打靶區域,利用網站(http://crispor.tefor.net)對打靶區域設計sgRNA,設計條件為: sgRNA的長度為20 nt,核心序列為NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(20)-NGG;在正義鏈模板的5’端添加CACCG,在反義鏈模板的5’端添加AAAC,使寡核苷酸鏈與載體質粒黏性末端互補。最終選擇兩個合適的靶點,命名為E1-1和E1-2。核酸序列見表1。

表1 sgRNA靶點的寡核苷酸序列

1.5 豬SST基因編輯載體的構建

以pSpCas9(BB)-2A-Puro(簡稱PX459)為載體質粒構建表達載體,載體質粒的信息見圖1。將E1-1和E1-2分別連接到PX459上,分別命名為PX459-E1-1、PX459-E1-2。載體構建具體步驟為:將公司合成的每對寡核苷酸稀釋至10 μmol/L,按16 μL ddH2O、2 μL 10×NEB Buffer 3、1 μL正義鏈和1 μL反義鏈的配比混合:混勻后在95 ℃下反應5 min,之后在室溫下自然退火;將寡核苷酸雙鏈插入到線性化的PX459,將1 μL線性化的PX459、3 μL退火產物、5 μL SolutionⅠ混合,加ddH2O至10 μL,然后在37 ℃下連接2 h;轉化:將5 μL連接產物加入到50 μL感受態細胞DH5α中,輕彈混勻,先冰置30 min,然后在42 ℃下熱激90 s；取出后再冰置5 min,先加入1 mL無抗體的培養基，搖配復蘇45 min,再涂布于含氨芐抗體的平板上,挑取單克隆繼續培養,提取質粒后酶切驗證,并通過公司測序檢測是否連接正確,測序引物為通用引物U6。

頂部兩行淺色序列是sgRNA替換區。圖1 質粒構建信息圖

1.6 成纖維細胞的培養及轉染

用含15%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基,在CO2濃度為5%、溫度為37 ℃的培養箱中培養成纖維細胞。在轉染前接種1個6孔板,每孔接種細胞量為1.2×105個,待細胞處于對數生長期、匯合度為80%左右時,用電穿孔轉染法進行轉染,轉染條件為：120 V/cm,脈沖時間3 ms,質粒添加量4 mg/mL[13]。

1.7 嘌呤霉素濃度的確定

在6孔板內以每孔106個成纖維細胞重新鋪板,培養24 h后,分別配制含嘌呤霉素1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 ng/μL的篩選培養基,進行培養,每2天更換新的篩選培養基。每天觀測存活細胞的比例,將7 d內殺死所有細胞的濃度定為最低篩選濃度。

在細胞轉染48 h后,重新接種細胞,使6孔板每個孔中約有10000個細胞,繼續培養,使細胞恢復到較好的狀態。在繼續培養48 h后,換新的培養基,并加入嘌呤霉素,嘌呤霉素的濃度為最低篩選濃度。每天觀察細胞的存活狀態。在嘌呤霉素加入72 h左右后,換新的不含嘌呤霉素的培養基,提取細胞的DNA,進行PCR檢測。

1.8 單克隆細胞的篩選及培養

待經過嘌呤霉素篩選后的單個細胞增殖為細胞團后,在顯微鏡下觀察大小適度的細胞團,并用記號筆在培養皿的底部標記細胞團的位置。移除培養基,用DPBS清洗兩遍。用無菌鑷子夾起一個克隆環,將克隆環底部粘上無菌凡士林,輕輕地將克隆環放在一個選定的克隆之上,用鑷子稍用力均勻按壓，以克隆環能穩定立在培養皿且密封為止。加50 μL 0.25%的胰酶到克隆環里,當細胞開始變圓時加100 μL的培養基,吹起細胞并吸取到96孔板中,再加100 μL的培養基到克隆環,吹吸后加到對應的孔中。每2天換1次培養基,待96孔板中的細胞長滿傳代至24孔板,最后傳代至6孔板中。

1.9 單克隆細胞的基因型鑒定

分別提取未轉染的細胞、轉染后48 h的細胞、單克隆擴繁的細胞的DNA進行PCR擴增。引物在第一外顯子兩側設計,序列分別為SST-E1-F:5’-ACGAGGGTAATGGTGCGTAA-3’； SST-E1-R:5’- CCTTACCTTAGCCTTGCCC-3’。PCR擴增體系為: Premix Taq 10 μL、SST-E1-F 1 μL、SST-E1-R 1 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 6 μL。PCR擴增條件為:94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環；72 ℃延伸5 min。將PCR擴增產物通過90 V電壓、2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離,并將單克隆細胞的PCR產物送至公司測序。

2 結果與分析

2.1 成纖維細胞的分離結果

經過7 d左右的培養,當成纖維細胞在組織塊周圍長成片并且匯合度逐漸達到90%時,將組織塊挑去可獲得原代細胞。腎成纖維細胞生長狀態較好,呈梭形,在顯微鏡下觀察，其細胞透明,邊緣清晰(圖2)。在傳代后生長迅速,2～3 d即可長滿6孔板。轉染前1 d消化細胞傳代后,轉染時細胞即處于對數生長期,活力最好,轉染效果最佳。

圖2 原代成纖維細胞

2.2 質粒構建的結果

將E1-1、E1-2分別與線性化的PX459質粒鏈接,然后用限制性內切酶驗證打靶質粒。設計用KPnⅠ+ApaⅠ雙酶切,酶切后兩條帶大小分別為2288和6886 bp。瓊脂糖凝膠電泳結果(圖3)顯示片段大小與預期一致,只是質粒濃度較高,部分未酶切。

1: E1-1; 2: E1-2。圖3 質粒酶切驗證結果

將酶切驗證后的質粒擴繁,提取菌液的質粒,經過公司測序,測序結構如圖3所示,sgRNA插入的方向、位置與預期相符,質粒構建成功。

下劃線的序列代表sgRNA正向序列。圖4 插入序列的測序圖

2.3 嘌呤霉素篩選效率的檢測

經過嘌呤霉素梯度濃度的篩選,發現：1.75 ng/μL和2.00 ng/μL濃度殺死細胞的效果相近,且都能在7 d內將細胞殺死；而低于1.75 ng/μL的濃度不能將細胞全部殺死,因此測試1.75 ng/μL和2.0 ng/μL對轉染后的細胞的篩選效率。

將轉染打靶質粒48 h后的細胞用含有兩種濃度嘌呤霉素的培養基培育72 h,收取細胞的基因組DNA作為模板,用特定引物SST-E1-F和SST-E1-R擴增DNA片段,預計原基因組片段為416 bp,打靶后片段為380 bp；瓊脂糖凝膠電泳顯示的結果(圖5)與預期一致。由于1.75 ng/μL和2.0 ng/μL兩種濃度的篩選效果相近,因此選擇1.75 ng/μL為篩選時嘌呤霉素的濃度。

1:嘌呤霉素濃度為2.00 ng/μL;2:嘌呤霉素濃度為1.75 ng/μL;3:嘌呤霉素濃度為0 ng/μL;4:野生型細胞;5:清水對照。圖5 混合細胞基因型鑒定結果

2.4 單克隆的基因型鑒定

單克隆鑒定是以經過轉染和嘌呤霉素篩選后由單細胞長成的克隆為模板,所用引物也為設計的SST-E1-F和SST-E1-R,預計原基因組片段為416 bp,打靶后片段為380 bp。以挑取的13個單克隆為模板,電泳圖如圖6所示,兩個克隆(1、2)沒有片段缺失,4個克隆(3、4、5、6)雙等位基因雜合片段缺失,7個克隆(7、8、9、10、11、12、13)雙等位基因片段缺失。經過測序鑒定,7株雙等位基因缺失細胞都是純合缺失細胞。

圖6 單克隆細胞PCR產物電泳結果

3 討論

隨著生活水平的日益提高,人們對動物性食品的需求越來越大。我國是畜禽產品消費大國,如何使畜禽能夠優質、足量地滿足居民的日常需求、提高畜牧業產品產量,是畜牧獸醫工作者面臨的重要任務。據目前的研究,SST在哺乳動物體內的主要生理功能和作用機制有兩個途徑：一是抑制生長激素的自發分泌；二是抑制其他因子刺激誘發的生長激素的分泌。由于生長激素釋放被抑制,所以動物的生長會受到一定程度的限制。畜牧生產行業通過調控畜禽機體內的SST水平,可以達到削弱或消除SST抑制作用的目的,采用的辦法主要有化學耗竭劑、免疫中和調控技術、工程疫苗三種方式[14]。目前,CRISPR/Cas9基因編輯技術已經被高頻地應用到生物研究中,技術逐漸成熟。本實驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在豬成纖維細胞中對SST基因進行了敲除。

本研究所用實驗材料是大白豬的腎成纖維細胞,該細胞在體外培養生長良好,原代的腎成纖維細胞界限分明,呈不規則梭形；傳代后死亡率低,95%左右能夠正常貼壁并不斷增殖；匯合度高的細胞呈較規則的梭形、流線形或柳葉形,整體排列為渦旋狀或流水狀；凍存再復蘇的細胞貼壁率為90%左右,貼壁后的生長狀態也非常良好,能滿足本實驗的要求。

在本實驗中單克隆細胞的挑選是主要難點。挑取單克隆細胞的方法有無限稀釋法、玻璃拉針劃板法、濾紙挑選法等。經過試驗發現,用無限稀釋法分離的單個細胞生長狀態較差甚至衰老速度極快,不能正常增殖,可能是由于單個細胞分泌的生長因子等物質較少,無法滿足正常增殖的需求。用玻璃拉針劃線法操作時對于貼壁狀態好的細胞效果較差,不能使整個細胞群脫離培養皿壁,或使大量細胞破裂,不能貼壁生長。用濾紙挑選法操作時比較麻煩,且消化的時間不好掌握。本實驗用自制的克隆環挑選單克隆細胞,環底部略大于克隆,將克隆環與培養皿底部完全封閉時,可以最大程度地吸取消化的克隆,且能在顯微鏡下觀察消化程度?？寺…h經過高溫滅菌,使用前再經過紫外照射,能避免感染微生物。使用時需注意底部是否封閉,若沒有完全封閉,則消化液漏出環外,會導致細胞隨消化液流失,使此克隆作廢,且會污染其他克隆。本實驗用此方法挑選的克隆經再次傳代后,死亡率低,貼壁狀態和生長狀態良好。