眼部成纖維細胞在眼科疾病中的研究進展△

劉 江 文 杭 項敏泓

成纖維細胞也稱為纖維母細胞，是疏松結締組織中最常見的細胞，在機體內廣泛分布。成纖維細胞可合成、分泌大量的細胞外基質(ECM)，促進傷口愈合，參與纖維化疾病的發生[1]。皮膚成纖維細胞參與受損皮膚的修復，促進傷口愈合及瘢痕形成[2]；肺部成纖維細胞產生的大量ECM沉積可引發特發性肺纖維化[3]；心肌成纖維細胞參與心肌細胞的重塑并導致不同程度的心功能衰竭[4]；肝臟成纖維細胞的增殖和活化會導致肝纖維化[5]等。同樣，眼部成纖維細胞在眼科的諸多疾病中起著重要的作用。本文就眼部成纖維細胞的生物學特征、體外培養的方法及其在眼科疾病中的研究進展作一綜述，以期指導臨床。

1 成纖維細胞的生物學特征

成纖維細胞形態多樣，主要有梭形、鹿角形和星形，胞核呈橢圓形，核仁大而明顯；胞質呈弱嗜堿性，含豐富且發達的粗面內質網、高爾基復合體及游離核糖體，因此具有強大的合成和分泌蛋白質的功能。此外，成纖維細胞還具備合成膠原纖維蛋白、粘連蛋白以及分泌膠原纖維、彈力纖維和網狀纖維的能力。當成纖維細胞處于低活性狀態時，稱之為纖維細胞。纖維細胞的胞體較小，呈長梭形，細胞質少[6]。在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞重新轉變為成纖維細胞，其合成和分泌蛋白質的功能也隨之恢復。在轉化生長因子-β1(TGF-β1)的誘導下成纖維細胞可進一步轉化為肌成纖維細胞，其可改變原有的組織張力，參與組織損傷后的修復[7]。

2 眼部成纖維細胞的培養方法

2.1 結膜松弛癥成纖維細胞將結膜松弛癥患者手術中切除的松弛結膜組織放入無菌生理鹽水中漂洗去除血污，剪成 0.5 mm×1.0 mm×1.0 mm大小的組織塊，平鋪于六孔板并置于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中，待組織塊接近干燥后再緩慢貼壁加入3 mL含體積分數10%胎牛血清和1 g·L-1青鏈霉素及成纖維細胞生長添加物的DMEM培養液，每3 d換液1次，2～5 d可見貼壁組織塊周圍有細胞溢出。經形態學觀察、免疫熒光染色及流式細胞術等方法鑒定后，傳至第3～5代的成纖維細胞可用于后續實驗[8]。

2.2 翼狀胬肉成纖維細胞將翼狀胬肉患者手術中獲得的組織塊置于DMEM培養液中，使用含有500×103U·L-1青霉素和500 mg·L-1鏈霉素的磷酸鹽(PBS)緩沖液對組織塊進行漂洗，再將組織塊剪成1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm大小，接種在涂有胎牛血清的培養皿中，加入培養基，置于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱過夜。每3～4 d換液1次。當細胞融合度達到70%～80%時將細胞轉移至培養瓶中繼續孵育，取第3～10代細胞進行后續實驗[9]。劉琳琳等[10]使用斜口培養瓶對翼狀胬肉成纖維細胞進行體外培養。無菌條件下將取得的翼狀胬肉組織樣本置于冰上，用PBS緩沖液沖洗后將組織塊修剪為0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，加入含體積分數12%胎牛血清的培養液，2～3 d后可見長梭形細胞從組織塊邊緣爬出，1 周后可長滿培養瓶，用胰蛋白酶消化后傳代。每2 d換液1次，4～6 d可傳代，取第3代細胞進行后續實驗。

3 成纖維細胞在眼科疾病中的研究進展

3.1 成纖維細胞與結膜松弛癥的相關研究結膜松弛癥是由于球結膜過度松弛和(或)下瞼緣張力過高造成松弛的球結膜堆積在眼球與下瞼緣、內眥、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學微環境異常，并伴有眼部干澀、異物感、溢淚等不適癥狀的眼病[11]。結膜松弛癥的發病機制目前尚未完全明確，可能涉及不同的因素，如結膜老化、淚膜不穩定、機械摩擦、淚液清除延遲等，其中結膜的膠原纖維溶解和彈力纖維變性是結膜松弛癥的致病因素之一[12]。李軼捷等[13]通過透射電鏡發現，結膜松弛癥患者球結膜固有層及筋膜組織中的膠原纖維減少、成纖維細胞發生變性。Xiang等[14]研究發現，結膜松弛癥患者松弛結膜組織中基質金屬蛋白酶(MMP)-1和MMP-3表達上調。由于MMP可促進ECM降解，其上調意味著膠原纖維溶解和彈力纖維降解的活性增加，導致結膜基質和眼球筋膜過度降解，出現球結膜變薄，松弛結膜組織堆積并形成結膜松弛癥。韓竹梅等[15]利用ELISA法檢測到結膜松弛癥患者成纖維細胞上清液中穿透素-3及腫瘤壞死因子-α刺激基因6的表達上調，證實炎癥反應相關蛋白穿透素-3、腫瘤壞死因子-α刺激基因6參與結膜松弛癥的發生發展。

嚴重的結膜松弛癥患者需要手術治療，但手術存在風險，且有一定適應證，因此更為安全的治療手段顯得尤為重要。研究發現，中藥杞精明目湯可下調結膜松弛癥患者成纖維細胞中 MMP-1、MMP-3的表達[16]。賈元玲等[17]采用杞精明目湯顆粒劑對體外培養的結膜松弛癥患者結膜成纖維細胞進行干預，檢測其絲裂原活化蛋白激酶信號通路相關蛋白及mRNA的表達，證實杞精明目湯可下調該通路的表達，從而起到治療結膜松弛癥的作用。

3.2 成纖維細胞與翼狀胬肉的相關研究眼部成纖維細胞參與翼狀胬肉的發生發展過程，包括細胞的增殖、遷移、纖維化、炎癥浸潤、血管生成和ECM的分解[18]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)在肌成纖維細胞中高表達，是成纖維細胞收縮的主要標志，可推動上皮細胞向間充質細胞轉變[19]。TGF-β1是纖維化的主要誘導劑，促進肌成纖維細胞分化，并誘導上皮-間質轉化[20]。研究發現，與正常結膜組織相比，翼狀胬肉組織中TGF-β1、α-SMA表達增強，提示眼部成纖維細胞的纖維化參與翼狀胬肉的發生發展[21]。在倒置顯微鏡下可見原代培養的正常人結膜成纖維細胞為典型樹突狀，而翼狀胬肉患者成纖維細胞則失去原始形態，表現為更加扁平的細胞，且伴有α-SMA和TGF-β1表達顯著升高[22]。彭娟等[23]發現，鼻、顳側均有翼狀胬肉的患者，其結膜成纖維細胞的增生、移行能力大于僅有單側翼狀胬肉和正常人的結膜成纖維細胞，且α-SMA的表達更強。

目前翼狀胬肉的治療以手術為主，傳統的抗代謝藥物如絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶等可抑制結膜下組織纖維化，減少疾病復發[24]，但可導致鞏膜溶解、眼內炎、黃斑病變、低眼壓等不良反應[25]，因此臨床需要新的抗纖維化藥物。Koga等[26]將翼狀胬肉患者成纖維細胞用丁酸酯或苯丁酸酯處理48 h，通過實時熒光定量PCR檢測α-SMA、I型膠原蛋白、III型膠原蛋白和MMP-1的表達，證實丁酸酯或苯丁酸具有抗纖維化的作用。Chen等[27]研究發現，迷迭香酸可下調I型膠原蛋白和TGF-β1/Smad的信號轉導，從而抑制纖維化。Tao等[28]將體外培養的翼狀胬肉患者成纖維細胞經200 g·L-1吡非尼酮處理后發現，其可有效抑制成纖維細胞的增殖、遷移和膠原蛋白的收縮，提示吡非尼酮可預防術后翼狀胬肉的復發。

3.3 成纖維細胞與角膜疾病的相關研究眼部的感染、手術和創傷，都可能會觸發原本透明的角膜組織中成纖維細胞的形成和進一步纖維化，從而使角膜失去透明性，甚至導致永久性的視力障礙。如堿燒傷可破壞角膜的完整性，誘導靜止細胞分化為成纖維細胞或肌成纖維細胞并表達α-SMA，參與組織修復與瘢痕形成[29]。一項對持續性角膜上皮細胞缺損的研究表明，角膜瘢痕的形成是肌成纖維細胞介導的纖維化過程[30]。LASIK術后，患者角膜瓣邊緣的窄帶出現肌成纖維細胞的轉化[31]，角膜基質層的纖維化總出現在LASIK患者的角膜瓣緣，這種纖維化有助于預防外傷所致的角膜瓣移位[32]。Luft等[33]對SMILE和飛秒激光輔助的LASIK(FS-LASIK)術后患者角膜基質層進行觀察發現，FS-LASIK 術后患者激光損傷部位纖維連接蛋白的表達較SMILE強。由于纖維連接蛋白是由角膜基質層中活化的成纖維細胞所產生，提示成纖維細胞參與FS-LASIK術后角膜基質的纖維化反應。

3.4 成纖維細胞與青光眼濾過手術后的瘢痕化青光眼是目前主要的致盲性眼病之一，降低眼壓是其主要的治療手段[34]。青光眼濾過性手術可有效降低眼壓，但術后患者可能出現濾過道的瘢痕化，成纖維細胞的增生和ECM的過度合成是濾過泡瘢痕形成的主要原因[35]。濾過性手術可激活Tenon囊的成纖維細胞(HTFs)，HTFs的激活導致纖維化蛋白的產生和過度增生，進一步引起濾過泡中過多的瘢痕形成[36]。研究發現，青光眼患者的房水中存在較高生物活性的TGF-β1，使青光眼患者小梁網中ECM沉積和纖維化加重[37]。青光眼術后濾過道的瘢痕中還存在細胞表型的轉化，表現為HTFs轉化為肌成纖維細胞[38]。晏維玲等[39]發現，在HTFs轉化為肌成纖維細胞的過程中，P53表達顯著升高，miR-29b表達明顯降低，推測P53與miR-29b之間的相互作用可調控瘢痕纖維化過程。邰雪等[40]研究發現，雷帕霉素可抑制兔抗青光眼術后濾過區組織的過度增生，保留功能性濾過泡，并誘導兔眼結膜成纖維細胞的凋亡，抑制青光眼患眼術后成纖維細胞的過度增生，預防瘢痕化的發生。

3.5 成纖維細胞與視網膜疾病的相關研究在諸多視網膜疾病中可見成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，例如增生性玻璃體視網膜病變(PVR)和年齡相關性黃斑變性(AMD)患者視網膜下發生纖維化[41]。

PVR是一種纖維化改變的病理過程，視網膜下膜或視網膜前膜的形成是PVR的主要特征。成纖維細胞和肌成纖維細胞被認為是視網膜前膜的主要細胞表型，其一旦收縮將會對視網膜形成廣泛的牽拉作用，導致視網膜皺縮和牽拉性視網膜脫離[42]。Shu等[43]認為這與肌成纖維細胞中α-SMA的表達增加有關，其可促使視網膜前膜中的肌成纖維細胞具有更持久的收縮特性，分泌更多的ECM和促纖維化因子，從而促使PVR膜收縮，最終導致不可逆的視力喪失。

新生血管向黃斑部的生長是AMD的標志性病理改變[44]，黃斑纖維化是AMD自然病程的終末期[45]。研究發現，AMD患者的脈絡膜新生血管膜中存在多種細胞，包括成纖維細胞、內皮細胞、視網膜色素上皮細胞、巨噬細胞，且在脈絡膜新生血管膜中檢測到α-SMA陽性細胞，它是肌成纖維細胞的特征性標志。肌成纖維細胞產生大量的ECM參與黃斑的纖維化，是驅動病原性纖維化的關鍵細胞[46]。

3.6 成纖維細胞與眼瞼基底細胞癌的相關研究在倒置顯微鏡下觀察發現，與正常成纖維細胞相比，眼瞼基底細胞癌患者成纖維細胞呈長梭形，細胞質突起減少，增生快速，排列不規則，可重疊生長，喪失了接觸抑制現象，且成纖維細胞特異性表達α-SMA、活化蛋白、波形蛋白等[47]。成纖維細胞活化蛋白是成纖維細胞活化后特異性表達的標志物，其在眼瞼基底細胞癌患者成纖維細胞中過表達，并通過調節 PTEN/PI3K/Akt 信號通路促進癌相關成纖維細胞的增殖，提示基底細胞癌患者成纖維細胞的遷移、侵襲與眼瞼基底細胞癌的發生密切相關[48]。

3.7 成纖維細胞與Graves眼病的相關研究Graves眼病是一種以炎癥、組織重塑、擴張和纖維化為特征的自身免疫性疾病[49]。研究證實，Graves眼病眼眶成纖維細胞中結締組織生長因子表達升高，其可直接或充當TGF-β1的下游介質來促進Graves眼病患者眼眶成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞并產生ECM[50]?；罨难劭舫衫w維細胞產生炎癥介質，這些炎癥介質又可促進肌成纖維細胞的分化，并刺激富含透明質酸的基質積聚，加劇眼眶組織的水腫和纖維化[51]。Graves眼病晚期，患者眼眶組織的纖維化會導致眼球運動受限、眼球突出，出現暴露性角膜炎和甲亢相關的視神經病變等[52]。

4 展望

由于成纖維細胞的增生、活化以及纖維化相關細胞因子在眼科疾病的發生發展起著重要的作用，因此需對成纖維細胞進行更為深入的研究。這將為眼部疾病發病機制的研究和治療領域的拓展提供更多新的思路。