天麻蜜環菌選擇性共生機理研究進展

楊林 王傳華 劉盼盼 周斌

摘要：天麻（Gastrodia elata Bl）具有較高的營養價值和藥用價值，已被醫學和藥學界廣泛關注，其食藥用價值正不斷地被研究認識和開發利用。通過對天麻與蜜環菌生物種的共生關系進行綜述，以期為天麻栽培育種提供參考。

關鍵詞：天麻;蜜環菌;共生機制

中圖分類號：S-3文獻標識碼：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200815005

收稿日期：2020-06-30

基金項目：銅仁市科技局項目（項目編號：2017TRS60223）;國家自然科學基金項目（項目編號：31570543）

作者簡介：楊林（1986-），男，碩士。研究方向：食用藥用真菌;通訊作者王傳華。

天麻（Gastrodia elata Bl.）為蘭科（Orchidaceae）多年生共生（Symbiosis）草本植物，是傳統名貴中藥，含豐富的多糖、天麻素、苷類、甾醇等活性物質，具有防癌、抗腫瘤、抗炎、鎮痛、抗衰老、降低血糖等效果。天麻自身無光合作用，需從入侵的蜜環菌中獲取營養物質而生長發育[1]。其種子的萌發，需從紫箕小菇（Mycena osmuudicola Lange）、蘭小菇（Mycena orchidicola）等共生萌發菌中吸收營養。而天麻種存在 6個遺傳性狀不穩定的變型，包括毛天麻（G.elata BL.f. pilifera）、綠天麻（G.elata BL. f. viridis）、烏天麻（G.elata BL. f. glauca）、松天麻（G.elata BL. f.alba）、紅天麻（G.elata B1.f.elata）和黃天麻（G.elata BL. f.falvida）[2，3]，其中烏天麻和紅天麻的利用價值最高[3]。

蜜環菌屬真菌（Armillaria（Fr.：Fr.）Staude）真菌隸屬擔子菌亞門（Basidomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae），其中部分種具有很高的食藥用價值。目前全球已鑒定出40多個生物種[4];我國已鑒定出14個有環的蜜環菌生物種和1個無環的蜜環菌（假蜜環菌），但僅有5個生物種A. gallica（高盧蜜環菌）、A. jezoensis（北海道蜜環菌）、A. sinapina（芥黃蜜環菌）和A. singula（單生蜜環菌）、A. solidipes（奧氏蜜環菌）能與天麻實現有效共生[5]，而有效共生的蜜環菌生物種對同種天麻具有不同侵染性，使得蜜環菌生物種與天麻間的共生關系存在選擇性。加之各蜜環菌生物種子實體和蜜環菌索的形態特征非常相似，而成為天麻栽培和產量中遇到的實際困難。

20世紀60年代以來，我國學者在天麻有性繁殖[6，7]、天麻生物學特性[8]、繁殖[6]、分類[2]、雜交育種[9]等方面研究取得了一定進展。出版了《天麻栽培學》專著[3]，實現了天麻的人工栽培。建立了部分天麻變型的高效液相指紋圖譜[10]。在蜜環菌入侵機制與天麻防御、消化、吸收過程等方面也進行一定研究[11-14]，確認了蜜環菌是天麻的主要營養來源;發現了天麻與蜜環菌之間包含著寄生、共生和反寄生3種關系[14]及正常生理侵染和病理侵染2種狀況[11];初步說明了密環菌種與天麻種之間存在選擇性[5，15，16]。綜合各方面的研究，蜜環菌生物種對天麻種的毒性、致病性等方面確實存在顯著差異。但其共生選擇性機制目前已取得相應進展，從而有望將成為我國天麻與其共生蜜環菌種的科學合理組合配種有效依據，也將突破我國菌農獲得優質、高產天麻的一道技術屏障?，F就目前天麻與蜜環菌的共生基礎特性做如下綜述。

1蜜環菌生物種菌索發育的研究

通過多年的研究，明確了蜜環菌以菌索形態侵染天麻，而天麻則同化蜜環菌而獲得營養[17]，蜜環菌菌株的生長速度與天麻產量呈正相關，蜜環菌的生長速度與菌材種類有密切關系[18]。菌索的生長和發育受碳源、氮源、無機營養[19]、維生素[20]、有機生長因子[21]、酚類物質[22]、植物提取液、某些氨基酸[23]、礦質營養狀態等因素的影響，鉀離子、有機物質[24]、松樹皮混合肥[25]能夠刺激其生長，高氮和磷則抑制其生長[24]。Garraway等[26]的研究也認為蜜環菌的生長發育受其生理和生物化因素影響。而Garrett[27]首次通過純培養研究了蜜環菌菌索的誘導，證實了實驗誘導蜜環菌產生菌索與營養因素有關。在菌種間的關系方面，曾春函等[28]采用8種密環菌兩兩組合培養研究蜜環菌菌索的相互作用，發現部分菌種存在相互拮抗作用，部分組合菌種菌索彼此出現“遠離”或“靠近”現象，同時兩兩組合在促進菌索發育速度存在明顯差異。因此可以推論營養、環境、遺傳是影響蜜環菌生長發育的關鍵因素。蜜環菌生物種對不同的天麻種具有不同的侵染性，是使蜜環菌生物種與天麻種之間存在選擇共生性的基礎;蜜環菌生物種之間具有拮抗效應和互交不育性，也是影響天麻產量的重要因素。同時許多研究[29-31]也支持不同蜜環菌菌種是影響天麻品質的重要因素。

2蜜環菌生物種侵染天麻的組織學過程研究

蜜環菌侵入天麻首先需要形成菌索，菌索附著在天麻表皮，由菌索長出菌絲，然后菌絲以機械力量和分泌化學物質[32，33]穿透到天麻皮層，菌絲侵入皮層最內層細胞后，以菌絲的形式沿著皮層細胞成束地向四周擴散[34，35]，同時菌絲釋放漆酶等化學物質，而漆酶的產生伴隨菌索的出現而出現[32];在此過程中應該是，蜜環菌產生的相應酶類首先消化天麻皮層細胞，被消化了的皮層細胞逐漸形成內吞管狀結構，在此過程中天麻收到皮層細胞被侵害信號后，誘導天麻內皮層細胞產生保護性措施，使之產生許多水解酶類，產生的酶被內質網或高爾基體包裹成小泡向細胞外運輸和釋放，被釋放的水解酶將入侵的菌絲降解為小分子物質被天麻吸收[14]，從而為天麻提供源源不斷營養助其生長。菌索入侵天麻的方式可能與Morrison等[36]研究蜜環菌侵染木材的形式相似，其侵染過程為蜜環菌首先在木材皮層外形成菌索，菌索分泌一些粘液基質覆蓋在菌索的生長點，菌索頂端變硬而附著，附著點的菌索長出菌絲，然后菌絲以機械力量和分泌化學物質穿透到寄主皮下。在蜜環菌侵入天麻的細胞結構研究中，徐錦堂等[37]研究表明蜜環菌菌絲由天麻皮層的菌絲流細胞經紋孔侵人大型細胞，其通道細胞被真菌所破壞而形成共生關系，但消化細胞通過反寄生而獲取密環菌的營養[14]。而董兆彬等[38]分別運用電子顯微鏡和光學顯微鏡研究了蜜環菌侵染天麻后皮層的3種細胞結構變化，得出天麻同化蜜環菌的過程需要經過若干皮層細胞和大型細胞共同完成。天麻細胞溶酶體是菌絲消化和自溶的重要細胞器，其中含有大量的酸性磷酸酶[39，40]。為了確定不同染菌細胞在消化蜜環菌過程中的作用，王貨等[13]采用酸性磷酸酶的細胞化學定位方法進行了研究，說明了天麻皮層細胞不能釋放水解酶消化菌絲，只有消化層細胞能釋放磷酸酶消化菌絲;因而說明天麻的皮層細胞中消化細胞層是天麻消化和吸收蜜環菌營養的主要場所，與Kusano[41]研究結果相同;但并沒有證明蜜環菌侵入天麻表皮層時天麻是通過何種誘導機制克服了蜜環菌的病理性入侵及其生理性變化。

在生理方面，胡忠[42]從天麻頂生球莖中分離出一種抗真菌蛋白（Gastsodia Antifungal Protein.GAFP），在天麻球莖外層組織中含量較多，內層薄壁組織沒有，認為該蛋白（GAFP）在天麻當年頂生和側生球莖中對阻止真菌的侵染和防衛中起重要作用。楊增明等[43]從天麻的初生球莖分離出幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶，顯示出其對蜜環菌的侵染防御性不高。Morrison[36]研究了全球不同地區23個蜜環菌生物種的毒性與菌索形態的關系，認為其侵染性與蜜環菌索的生長特性密切相關，進一步說明不同蜜環菌對天麻表皮層細胞侵染性不同。

3蜜環菌胞外酶對天麻的影響

近年來，許多研究者也注意到蜜環菌和天麻的胞外酶對兩者的生長發育起著關鍵作用，王賀[13]用溶酶體酸性磷酸酶的細胞化學方法詳細研究了兩者之間的關系，發現天麻皮層消化細胞是釋放水解酶消化真菌的主要場所。鄒寧等[44]采用蜜環菌（A.mellea）的胞內胞外提取物對天麻進行組織培養，得出胞內提取液有相應的抑制效果，胞外提取液有促進效果。曾春函等[45]研究了8種蜜環菌的胞外漆酶、果膠酶和纖維素酶的生物活性，得出各蜜環菌首先分泌果膠酶和纖維素酶，然后才是漆酶。劉曉杰等[46]研究了黃綠蜜環菌的葡萄糖基轉移酶酶活性，結果表明30℃下酶活穩定性最高，pH值在6～7范圍內酶活穩定最好。而譚彧文等[47]采用蜜環菌與天麻實現共生的區域，獲取其RNA進行轉錄組分析，得出蜜環菌侵入到天麻內皮層后，胞外酶纖維素酶、木聚糖酶、漆酶以及多聚半乳糖醛酸酶基因大部分處于下調狀態，與曾春函等[45]的研究結果相吻合。說明蜜環菌侵入天麻內皮層后其侵染性基因受到相應地抑制。

4天麻營養的供給

蘭進等[48]運用顯微放射自顯影的方法研究了蜜環菌吸收消化3H-葡萄糖后再侵染天麻的過程，得出蜜環菌能吸收消化周圍環境中的3H-葡萄糖，吸收3H-葡萄糖的蜜環菌再侵染天麻皮層細胞時，菌絲被溶解、消化，然后經天麻維管運輸使3H分布于天麻細胞的各個細胞器中。王貨等[14]認為天麻攝取真菌營養的過程是一個復雜的消化吸收過程，其為先消化后吸收，且是天麻營養的主要來源。徐錦堂等[1]的研究表明，蜜環菌索侵入天麻營養莖、繁殖莖后，形成菌絲流，其向內直接侵入大型細胞被天麻消化作為營養;而切斷天麻與菌材連接的蜜環菌索，新生麻就停止生長。說明菌絲通道是天麻整個生長期營養的補給線。莊毅[49]通過同位素標記方法，得出天麻除從蜜環菌獲得營養外，還可以從土壤中得到補充。吳沿友等[50]研究認為天麻礦物質吸收途徑：通過蜜環菌的“泵”作用獲得;天麻自身也可直接從外界環境獲得部分養分。

5天麻防衛系統和“食菌”系統

胡忠[42]從天麻頂生球莖中分離抗真菌蛋白（Gastsodia Antifungal Protein.GAFP），球莖外層組織富含，內層薄壁組織沒有。認為該蛋白（GAFP）在阻止真菌對當年生頂生和側生球莖的侵染和防衛機制中起重要作用。之后江流等[51]采用免疫熒光定位法，證實了GAFP在天麻次生塊莖表皮含量較高，皮層相對較低。同時胡忠等[52]也采用免疫熒光法說明了GAFP是密環菌侵染天麻營養莖后被大量合成，之后輸送至頂生球莖，積累于皮層細胞，是使頂生球莖處于拒菌狀態的一種重要蛋白。胡忠等[53]又深入地研究了GAFP-Ⅰ的氨基酸序列和cDNA核苷酸序列，得出GAFP抗菌活性可能與蜜環菌表面某種糖配基專一結合而發揮作用。而徐榮華等[54]運用熒光試劑異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate， FITC）標記法，證明了GAFP對木霉菌絲作用位點在細胞壁上。劉成運[55]借助于熒光顯微鏡研究了蜜環菌侵染天麻過程中的一系列變化，發現酸性磷酸酶、脂酶主要分布在含蜜環菌菌絲的天麻皮層細胞，而脂酶在大型細胞的叢狀體、崩解核及含菌絲的天麻皮層細胞活性強烈。ATP酶、多酚氧化酶、過氧化物酶在天麻菌絲皮層細胞和大型細胞內活性明顯。通過對天麻營養來源的進一步研究，許多研究認為皮層細胞和大型細胞參與了消化，而天麻皮層的抗真菌蛋白是抵御蜜環菌入侵的主要物質[3，42，56，57]，皮層細胞、消化細胞釋放溶菌酶、消化酶、幾丁質酶等對入侵菌絲流發揮消化起關鍵作用[3，55]。而實踐也證明只有健康的菌索能與休眠期和萌發期的原生球莖實現共生生長，不能與新生和旺盛期天麻實現共生。

6問題與展望

綜合以上各方面的研究，天麻與蜜環菌的選擇機制還需進一步研究，相比其它真菌的侵染植物體系均存在相應的誘導機制、向觸性，當蜜環菌侵入植物體后是如何實現共生關系的，實現共生關系的機制如何，目前知之甚少。而在蜜環菌侵入天麻皮層后，天麻植物體內多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL又是怎樣表達與調控的，在這過程中又發揮著何種作用，都還不甚了解。雖然在蜜環菌基因研究方面有了一些研究，但是均為菌種的鑒定方面，如Tsykun等[58]研究了歐洲6個蜜環菌種的3個DNA核糖體區域基因（IGS-1，ITS，EF-1a）的表達性;但是在天麻相應基因是如何誘導相應的蜜環菌為其提供營養及其如何防御蜜環菌進一步侵入使其不發生病理性侵害這方面研究得很少。然而天麻生物種基因的差異性表現出的調控能力和蜜環菌生物種基因表現出的侵染強弱應該是天麻生物種與蜜環菌生物種選擇共生性的基礎。同時，從天麻生長繁衍的角度看，天麻生物種對相應蜜環菌的誘導性強大，蜜環菌的入侵性較弱，則天麻生長;相反，如果誘導性較弱，入侵性較強，則天麻被吞噬，因此只有具備強大的誘導系統的天麻種與入侵較弱的蜜環菌種結合，才能使天麻通過相應的策略獲得營養以維持自身的生長繁衍。為此天麻對蜜環菌的選擇共生機制還需進一步研究明確。

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（責任編輯李媛媛）