基于細胞代謝活性的抗菌材料抗菌性能快速檢測研究進展

呂想 滿東楠 林如夢 唐喬 劉鵬鵬

摘 要：抗菌性能檢測是衡量抗菌材料性能的關鍵指標。傳統的抗菌檢測方法步驟繁瑣，檢測周期長，對檢測人員和環境的要求較為嚴格，與現代抗菌檢測發展要求較不相匹配。而抗菌性能的快速檢測可縮短檢測周期、提高材料利用率、降低廢棄物處理難度，因此建立一種簡單高效的抗菌性能快速檢測方法成為抗菌行業發展的迫切任務。本項目擬建立一種將2，3，5-三苯基氮化四氮唑（TTC）應用于快速檢測，以細菌代謝活性為基礎具有高效準確的特點的抗菌材料抗菌性能的快速檢測方法。

關鍵詞：抗菌活性;抗菌性能快速檢測;2，3，5-三苯基氮化四氮唑

抗菌材料是指以抗菌劑作為有效抗菌成分的材料[1]?？咕牧现械目咕鷦┏煞志哂心軌蛞种莆⑸锷L繁殖甚至殺滅微生物的功能，用這些抗菌材料制成的各種制品可減少細菌交叉感染的機會，從而達到長期衛生、安全的目的。近年來，隨著抗菌材料在醫療用品、生活用品、食品包裝材料和建筑材料等領域的廣泛應用，抗菌材料的開發和應用已逐漸成為研究的熱點。在抗菌材料研制開發過程中不可避免的要用到抗菌性能檢測的方法，目前抗菌性能檢測方法均需采用培養基對細菌培養，通過平板計數測算抗菌活性，具有檢測周期長（一般3至5天），操作復雜等缺點，且對操作環境和人員技術能力要求較高。建立一種簡單快速準確的材料抗菌性能檢測方法已迫在眉睫。2，3，5-三苯基氮化四氮唑（2，3，5-triphenyltetramLiumchloride，縮寫為TTC），細菌代謝過程中產生的琥珀酸脫氫酶可將其還原，其還原產物為不溶于水的深紅色三苯甲臢（TTF）。TTC溶于水中成無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲臢（TTF），TTF比較穩定，不會被空氣中的氧自動氧化。嗜中溫性需氧菌在其新陳代謝過程中產生的琥珀酸脫氫酶可以使無色的TTC還原為紅色的TTF的特性，故可以將TTC作為細菌生長的指示劑[2-3]。而將該原理應用于抗菌材料抗菌性能的研究尚未見研究報道。

1 抗菌材料抗菌性能快速檢測研究進展

1.1 現有方法

目前抗菌材料抗菌性能檢測的方法主要有振蕩法、吸收法、貼膜法及瓊脂擴散法等，根據檢測對象的不同可主要分為抗細菌能力檢測和抗真菌能力檢測兩大類。

1.1.1 抗細菌能力的測定方法及對比

抗細菌能力檢測方法分為三大類，分別是貼膜培養法和浸漬法、接觸法或包埋法及振蕩法。貼膜培養法和浸漬法

需要菌液與樣品接觸培養較長時間，培養過程中需要控制的條件較多，包括細菌活性、細菌所需營養、濕度、溫度等條件，有可嚴格定量的優點。接觸法或包埋法采用使樣品直接接觸混有菌液的培養基或包埋其內的方法，進行不同時間的培養后，觀察細菌在樣品及其周圍的生長情況和樣品受侵蝕情況，存在周期長和不便作為產品質量控制的定量評價的缺點。振蕩法是將樣品浸泡在一定濃度的菌液中，對其不斷進行振蕩培養，定時采用活菌計數法計算抗菌率，適用于織物、泡沫塑料、一次性衛生用品等的測定。

1.1.2 抗真菌能力的測定方法

抗真菌能力檢測方法分為兩大類，分別是接觸法和暴露法。接觸法與檢測抗細菌能力的方法一致，將樣品貼于培養基上，在樣品及培養基表面均勻地噴灑一定量的混合孢子懸液，培養一定時間，定期觀察，觀察菌生長情況分等級評價抗菌材料的抗霉菌性。暴露法是將樣品暴露于霉菌生長的場所后測定樣品的長霉程度，有操作不便和污染環境的缺點。

1.2 優缺點及適用范圍

上述各種檢測方法都對操作人員的操作要求較為嚴格并且都需要一定的培養時間，檢測周期比較長，為抗菌檢測帶來諸多不便。所以設計一種新的快速檢測方法成為抗菌制品發展的需要。

2 TTC顯色檢測原理及現有應用

2.1 檢測原理

TTC顯色檢測法即是基于TTC這一種氧化還原染料與活細胞內的脫氫酶反應，被還原為紅色的TTF，其基本原理是活細胞中的呼吸酶的活躍情況能較正確地表現細胞活性的強弱，同時氧化還原染料會再呼吸酶的作用下使細胞著色，所以可以根據著色情況來判斷細胞的活力[4]。

2.2 現有應用

TTC法的優點是可以應用于許多活細胞上且測定結果都比較精確，但存在有無活性的界限不明確，容易出現測量值偏高，上色所需時間較長，容易褪色等缺點。目前，TTC法主要用于農業科學方面，常用于：

2.2.1 花粉生活力測定

其基本原理是花粉中呼吸酶的活躍情況能較正確地反映其生活力的強弱，同時氧化還原染料能在呼吸酶的作用下著色，因此可根據著色情況來判斷花粉的生活力。具體操作過程為：第一步，取少數花粉置于載玻片上，加1-2滴TTC溶液，蓋上蓋玻片。第二步，將制片放置35℃恒溫箱中15min，然后在低倍鏡下觀察。凡是染成紅色的花粉，其生活力為強，淡紅的次之，無色的為不具活力的花粉或不育花粉。第三步，觀察2-3個制片，每片取5個視野，統計100粒，然后計算花粉的活力百分率[5]。

2.2.2 植物根系活力測定

顯色。取根和側根，每重復分別均稱取一定重量（約0.5g）樣品，依次加人0.4%TTC溶液和（1/15）mol/L磷酸緩沖液各5mL，充分混合，并使根尖切段完全浸入上述反應液中，于37℃的恒溫箱內以黑暗條件培養2h，以使根尖切斷顯色[6]。

2.2.3 植物種子活力測定

配制0.05%、0.10%、0.50%TTC溶液，避光保存，溶液一旦變成紅色不能再用。樣品處理與紅墨水染色法相同。每個培養皿中分別加入0.05%、0.10%、0.50%TTC溶液，然后將其放在30℃左右的恒溫箱中1.5h左右，隨后將TTC溶液倒掉，并用水反復沖洗幾次，觀察染色情況。胚部呈紅色的則具有生活力，呈淺紅色的具有較弱的生活力，無色的便是無活力種子。但發芽試驗發現呈淺紅色的一般也可發芽，所以呈淺紅色的也算具有發芽能力[7]。

2.2.4 各種活細胞的活力測定

將在一定的培養基上培養的酵母菌落上覆蓋一層TTC顯色劑，TTC會顯不同的顏色，產酒精能力強的酵母會顯現深紅色，次之顯粉紅色，微紅色的或不顯色的為野生酵母。使用TTC平板法篩選西瓜酒酵母可以篩選出產酒精[8]。

3 TTC顯色方法建立

3.1 材料

M-H瓊脂培養基、M-H肉湯培養基、TTC、琥珀酸鈉、質控菌株，供試菌株、藥敏試紙。

3.2 試驗方法

3.2.1 TTC顯色培養基指示劑適宜濃度的確定

3.2.1.1 制備試驗菌液

取質控菌株新鮮斜面，挑取1塊接種環菌苔移至9mL肉湯培養基，置35℃下培養4-6h，制成新鮮菌液，將新鮮菌液用0.9%氯化鈉滅菌溶液倍比稀釋成含菌量為50-150CFU/mL的供試菌液。

3.2.1.2 1%TTC儲備液的制備

取1gTTC、2g琥珀酸鈉溶于100mL生理鹽水，121℃滅菌鍋處理15min備用。

3.2.1.3 含TTC梯度質量分數培養基的制備

配制M-H瓊脂培養基，121℃高壓滅菌15min。分別取

0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL質量分數1%的TTC儲備液加入到100mL經高壓滅菌冷卻至50-60℃的M-H瓊脂培養基內搖勻，配成6級含TTC系列質量分數的培養基。

3.2.1.4 TTC系列質量分數培養基對大腸桿菌菌落的顯色反應及抑菌性試驗

按《中國藥典》附錄微生物限度檢查法中菌落計數的方法，將含菌量為50-150CFU/mL的供試菌液1mL加入滅菌平皿中，用含不同TTC質量分數的M-H瓊脂培養基15mL澆碟（每質量分數為1組，每組6個平皿），同時以不加TTC的M-H瓊脂培養基15mL澆碟（6個平皿）作為對照組。35℃培養箱中培養16-18h，觀察各試驗組和對照組的菌落顏色并進行菌落計數，計算平均菌落數。

3.2.2 TTC顯色快速藥敏試驗

為了獲取供試菌株TTC顯色快速藥敏試驗所需時間和敏感度方面的數據，本試驗將參考藥敏紙片試驗的結果及藥物分類代表，選取多種獸醫臨床常用藥物的藥敏紙片進行藥敏試驗。①制備試驗菌液：取供試菌株制備0.5個麥氏單位濁度的細菌懸液;②制備TTC顯色培養基：配制M-H瓊脂培養基，高壓滅菌后冷卻至50-60℃，按1000mL加3mL的比例加入1%TTC儲備液，配成含0.003%TTC的顯色培養基，倒入無菌培養皿;③接種平板：用1個無菌棉拭子蘸取菌液，并在上端管壁旋轉擠壓幾次，去掉過多的菌液。用拭子涂布整個瓊脂平板表面，反復涂布幾次，每次將平皿旋轉60°，保證涂布均勻。蓋上平皿，室溫下放置3-5min，使培養基表面的水分蒸發，然后貼藥敏紙片;④貼藥敏紙片：用無菌鑷子將藥敏紙片貼于平皿上，每個平皿貼6種藥敏紙片。紙片要貼得均勻，紙片與紙片中心距離不小于24mm，紙片中心距平板邊緣不小于15mm。貼上紙片15min內，把平皿倒放在35℃培養箱中培養16-18h;⑤孵育：TTC顯色半固體瓊脂置37℃孵育2、3、4、5、10、15、18h，取出測量抑菌環直徑;⑥結果判讀：按美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）制定的標準進行判讀，以敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）的形式解釋結果;⑦質量控制：每次試驗用質控菌對所有鑒定用試劑及藥敏分析用抗生素紙片進行質量控制，以符合預期結果和NCCLS的藥敏質控標準。

4 展望

近年來，抗菌材料的使用更加廣泛，抗菌材料的開發和應用已逐漸成為研究的熱點，在抗菌材料研制開發過程中不可避免的要用到抗菌性能檢測的方法，本項目以抗菌材料為研究對象，根據細菌代謝過程產生琥珀酸脫氫酶還原TTC顯色的原理，通過抗菌材料與細菌的接觸培養、TTC顯色劑顯色反應、顯色程度或變色時間、TTC還原產物TTF的濃度測定等多方面的研究，擬建立一種準確、有效的基于細菌代謝活性的抗菌材料抗菌性能快速定性、定量檢測方法?？焖贆z測方法可以用于抗菌產品的生產在線抽檢，隨著生產檢測控制產品質量，也可以用于抗菌性能演示和消費者自行檢測，確保讓消費者自己了解所售產品的抗菌性能，促進抗菌行業健康快速的發展。

參考文獻：

[1]麻曉霞，裴陽陽，雷云，等.負載型無機抗菌材料的研究進展[J].功能材料，2017，48（009）.

[2]劉慧.現代食品微生物學[M].北京：中國輕工業出版社，2006：325-336.

[3]白士茂.氯化三苯基四氮唑對細菌生長指示的適用性研究[J].浙江實用醫學，1997，000（002）：12-13.

[4]王欽麗，盧龍斗，吳小琴，陳祖鏗，林金星.花粉的保存及其生活力測定[J].植物學通報，2002（03）.

[5]胡適宜.植物胚胎學實驗方法（一）：花粉生活力的測定[J].植物學通報，1993（02）：60-62.

[6]鄭堅，陳秋夏，金川，等.不同TTC法測定楓香等闊葉樹容器苗根系活力探討[J].浙江農業科學，2008（01）.

[7]張薇，耿雷躍，楊雅華，張啟星.水稻種子活力的快速測定方法[J].現代農業科技，2015（08）.

[8]胡曉冰，王振偉.TTC法在篩選西瓜果酒酵母中的應用[J].釀酒科技，2011（02）.

基金項目：

國家級大學生創新創業項目（項目編號：201910356020），

浙江省質量技術基礎建設項目（項目編號：20180116）。