大蒜抗根結線蟲內生細菌的篩選及盆栽防效試驗

黃開偉　李敏敏　史倩倩

摘要：利用稀釋涂布平板法，從受根結線蟲為害的大蒜根須組織研磨液中篩選對根結線蟲有明顯抑殺效果的內生生防細菌。結果表明，在盆栽試驗中，菌株S1-1對根結線法的殺線蟲由活性為90.8%。通過盆栽試驗驗證生防菌株的防效，菌株S1-1防效為74.86%。結合菌株形態特征、分子生物學和生理生化特性，將菌株S1-1鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

關鍵詞：根結線蟲;生防細菌;篩選;芽孢桿菌;試驗

中圖分類號：S436? ? ? 文獻標志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.038

Abstract：The screening and identification of biocontrol bacteria from garlic root against root-knot nematode was performed using dilution methode. The results showed that the nematicidal activity of strain S1-1 against Meloidogyne incognita was 90.8%，and biocontrol effect of strain S1-1 was up to 74.86% against Meloidogyne incognita in pot experiment. Combined its morphlogicul characteristics，morphological characteristics and biochemical characteristics，Strain S1-1 was identified as Bacillus pumilus.

Key words：root-knot nematode;biocontrol bacteria;screening;Bacillus spp.;experiment

根結線蟲病是如今設施農業中重要的土傳病害之一，每年在全球范圍內造成的損失高達1 000億美元[1-3]。根結線蟲寄主范圍十分廣泛，大部分農作物都可以成功侵染，嚴重時作物減產高達75%以上。利用稀釋涂布平板法從受根結線蟲為害的大蒜根須組織研磨液中進行根結線蟲生防細菌的篩選，并得到一株對根結線蟲具有較好防治效果的芽孢桿菌菌株，為根結線蟲的生物防治提供了資源。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

1.1.1? ?植物樣品

山東青島采集的受根結線蟲為害的大蒜樣品。

1.1.2? ?供試線蟲

南方根結線蟲，青島農業大學植物醫學學院線蟲實驗室提供。

1.1.3? ?LB固體培養基（LBA）培養基配方

胰蛋白胨5 g，酵母抽提物2.5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉7.5 g，蒸餾水定容至500 mL，pH值7.0。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?生防細菌的分離

稱取受根結線蟲為害的大蒜根須10 g，用1%的次氯酸鈉消毒5 min，再用無菌水漂洗3遍，放入滅菌研缽中研磨成糊狀，然后用少量無菌水洗入裝有90 mL無菌水的三角瓶中;充分混勻后靜置10 min;吸取100 μL稀釋液均勻涂布在LBA培養基于37 ℃恒溫培養2～3 d;挑取形態不一樣的單菌落用平板劃線法分離純化，將得到的菌株轉接到LBA培養基斜面培養24 h，于4 ℃下進行保存。

1.2.2? ?南方根結線蟲懸浮液制備

從南方根結線蟲的空心菜上挑取成熟的線蟲卵塊，用0.5%的次氯酸鈉消毒1 min，無菌水沖洗干凈。將卵塊收集到滅菌培養皿中，加入少量無菌水，于28 ℃下恒溫孵化，48 h后收集孵化的線蟲，備用。

1.2.3? ?生防細菌的篩選

挑取4 ℃保存于LBA培養基斜面的菌株，于LBA平板上劃線、活化，1 d后挑取單菌落轉接到裝有100 mL的LB液體培養基的三角瓶中，于37 ℃，200 r/min培養48 h。發酵結束后，取發酵液以轉速? 9 000 r/min離心10 min，取上清液備用。取24孔板向其中加入1 mL上清液，對照組加等量無菌水，挑入大約50條線蟲，于28 ℃下恒溫培養，記錄24 h后線蟲死亡數，計算線蟲的校正死亡率。篩選出對南方根結線蟲觸殺效果強的生防菌株。

1.2.4? ?生防菌形態觀察

將對根結線蟲直接觸殺效果良好的細菌在LBA培養基平板上劃線，于37 ℃下恒溫培養24 h，觀察細菌的單菌落形態，再對菌株進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.5? ?生理生化鑒定

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》8與《常見細菌系統鑒定手冊》9對篩選出來的根結線蟲觸殺效果良好的生防細菌進行伏-普試驗、檸檬酸鹽利用試驗等生理生化鑒定。

1.2.6? ?細菌DNA的提取及16 SrDNA基因序列分析

利用OmegaBio-Tek試劑盒提取生防芽孢桿菌的DNA;采用16 SrDNA細菌通用引物27F/1492R進 行PCR擴增;PCR反應體系（25 μL）：10X Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物27F/1492R各1 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 16 μL，模板DNA 2 μL;反應參數：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s。63 ℃退火30 s;72 ℃延伸90 s;共35個循環;72 ℃總延伸7 min;4 ℃保存。PCR擴增后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將擴增產物送至北京擎科新業生物技術有限公司測序，經過NCBI數據庫進行BLAST比對分析，構建系統進化樹。

1.2.7? ?根結線蟲生防細菌盆栽防效試驗

待供試番茄（麗春）長出第4片真葉后，進行細菌發酵液的制備，菌體濃度最終調成1×107/mL。在處理組番茄根部澆20 mL生防菌發酵液，對照番茄根部僅澆灌無菌水。3 d后，在番茄根部均勻接種南方根結線蟲二齡幼蟲（1 000條/株），每個處理20棵番茄，接種37 d后調查番茄發病情況，參考Bridge和Page的方法對根結分級[4]，統計番茄的根結數和病情指數計算出防效。

根結線蟲的根結分級判定見表1。

2? ?結果與分析

2.1? ?拮抗線蟲生防細菌篩選結果

通過稀釋涂布平板法初步分離出102株細菌，再通過南方根結線蟲直接觸殺試驗進行復篩得到4株對南方根結線蟲生防效果較好的細菌。其中，S1-1菌株于37 ℃，200 r/min培養48 h后其發酵液對南方根結線蟲的致死率達到90.08%。

生防菌發酵液對南方根結線蟲的觸殺防效見? 表2。

2.2? ?菌株S1-1的形態特征

S1-1在LB培養基上菌落顏色為污白色，菌落形狀呈雜草狀散生，在10%的NaCl培養基上菌落形態為圓形、邊緣較整齊、表面光滑、菌落不隆起、不透明、培養基顏色未見明顯變化。經革蘭氏染色后，菌株形態為桿狀，呈紫紅色，因此S1-1是革蘭氏陽性菌。

2.3? ?菌株S1-1的生理生化特征

芽孢桿菌DR2-1和S1-1的生理生化特性見表3。

2.4? ?菌株S1-1基因序列分析結果

對菌株S1-1的16S rDNA基因序列用Blast進行序列比對分析，并構建系統發育樹。通過系統發育樹發現，菌株S1-1與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）屬同一個分支，結合菌株形態特征和生理生化鑒定結果，可以鑒定菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

2.5? ?菌株S1-1對南方根結線蟲的防效測定

通過盆栽試驗進一步測定菌株S1-1對南方根結線蟲的防治效果。結果表明，施用菌株S1-1的發酵液后，處理組番茄根結數目及病情指數明顯低于對照組，防治效果達到74.86%，表明菌株S1-1對南方根結線蟲具有良好的防治作用。

南方根結線蟲盆栽試驗見表4。

3? ?結論

從受根結線蟲為害的大蒜根須中共分離出4株對南方根結線蟲直接觸殺效果較好的生防細菌。盆栽防效試驗結果表明，菌株S1-1對南方根結線蟲具有良好防效。結合菌株形態特征和生理生化鑒定結果，鑒定該菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

參考文獻：

趙鴻，彭德良，朱建蘭. 根結線蟲的研究現狀[J]. 植物保護，2003（6）：6-9.

劉維志. 植物線蟲志[M]. 北京：中國農業出版社，2003：124-130.

李曉平. 劇高毒殺線劑相繼被禁限用將為環保低毒新殺線劑騰挪市場空間[J]. 農藥市場信息，2018（27）：30-33.

Bridge J，Page S L. Estimation of root-knot nematode infestation levels on roots using a rating chart[J]. Tropical Pest Management，1980（26）：296-298. ◇