14株鴨疫里默氏桿菌的部分生物學特性分析

左春生 李迎曉 徐光科

摘要：為了解鴨疫里默氏桿菌的流行情況，對信陽地區疑似鴨疫里默氏桿菌感染病料進行病原分離和鑒定。結果顯示，共鑒定到14株鴨疫里默氏桿菌，其中血清1型、2型和10型菌株依次為3、4、2株，未定血清型菌株5株;動物致病性試驗結果顯示，分離菌對雛鴨均具有致病性。對11種抗菌藥物敏感性檢測結果表明，分離菌株對阿米卡星、鏈霉素和頭孢曲松較為敏感，對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B和多西環素耐藥性較高;生物被膜檢測結果表明，14株菌株中有8株為強生物被膜形成株，2株為弱生物被膜形成株。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌;分離鑒定;血清型;藥敏試驗;生物被膜

中圖分類號： S855.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）15-0221-05

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）可感染鴨、鵝、火雞等多種禽類，是目前規?；蒺B殖多發的細菌性疾病，常造成嚴重的經濟損失。鴨疫里默氏桿菌主要侵害2～7周齡的雛鴨和仔鵝，特征性病變為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、關節炎、輸卵管炎和腦膜炎等[1]。

我國郭玉璞等在1982年首次報道北京地區商品鴨發生鴨傳染性漿膜炎后[2]，其他主要水禽養殖區域陸續報道發現該病。鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，至少有21個血清型，且各型之間幾乎無交叉保護性，已成為危害養鴨生產的主要疾病[3]。信陽市是河南省主要的水禽集散地，部分養殖戶使用血清1型和血清2型RA滅活疫苗免疫后，預防效果不佳。因此，本研究通過對實驗室送檢的疑似鴨疫里默氏桿菌感染病料進行細菌分離和血清型鑒定，旨在為河南省信陽市水禽鴨疫里默氏桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品為養殖戶送檢的發病雛鴨。

1.2 主要試劑與試驗動物

胰蛋白胨大豆（TSA）瓊脂培養基、胰酪胨大豆肉湯（TSB）培養基，購自杭州天和微生物試劑有限公司;即用型SanPfu PCR試劑盒、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司;鴨疫里氏桿菌1型、2型菌株和RA標準血清由上海獸醫研究所胡青海博士惠贈;1日齡健康非免疫櫻桃谷鴨，購自河南華英農業發展股份有限公司，隔離飼養至15日齡后用于細菌致病性試驗測定。

1.3 細菌學檢查

無菌采集病死雛鴨肝臟、腦等病料，劃線接種于TSA平板，置于燭缸中37 ℃培養36～48 h，挑取可疑菌落轉接種TSA培養基（含5%胎牛血清）純培養后，革蘭氏染色和瑞氏染色后檢查細菌形態。挑取TSA培養基純化后的單菌落轉接種TSB培養基（含5%胎牛血清）增菌培養后待用。

1.4 生化試驗

參照文獻[4]方法，取TSA培養基上純化的單菌落接種細菌生化反應管，37 ℃培養規定時間后觀察并記錄結果。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 細菌基因組的提取 挑取單菌落接種5 mL TSB培養基，37 ℃、200 r/min振搖培養過夜。取 500～1 000 μL進行細菌基因組提取，操作步驟按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒說明書進行。

1.5.2 16S rRNA基因和dan B基因PCR檢測 根據文獻[5]方法，設計檢測RA 16S rRNA基因和dan B基因的2對引物，擴增片段長度分別為364、627 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物詳情見表1。

PCR反應體系50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板2 μL，超純水19 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃延伸 5 min。

PCR產物用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在GenBank數據庫中進行Blast分析比對。

1.6 血清型鑒定

參照程安春等的方法[6]，將各RA分離株菌液和RA1、RA2、RA10型標準血清進行平板凝集試驗，觀察記錄結果。

1.7 動物致病性試驗

參照任小梅等的方法[4]，將鑒定后的14株RA分離株分別腿部肌肉注射進15日齡的櫻桃谷鴨或麻鴨，注射劑量為0.5 mL/羽（約1×108 CFU），每組3羽，同時設立對照組，腹腔注射0.5 mL滅菌生理鹽水。攻毒后每天觀察并記錄各組發病、死亡情況。

1.8 藥敏試驗

以大腸埃希菌（ATCC 25922）作為質控菌株，參照CLSI推薦的藥敏試驗紙片擴散法測定14株供試菌株對11種抗菌藥物的耐藥表型。結果依據CLSI標準判定各分離菌株的敏感性，以敏感、中介、耐藥3種形式記錄[7]。

1.9 鴨疫里默氏桿菌的生物被膜檢測

參照文獻的方法[8]將14株鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌DH5a的新鮮菌液（D600 nm=1.0）采用TSB進行1 ∶ 100稀釋后，加入96孔板，200 μL/孔，每株細菌設3個重復，然后置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中靜置培養24 h后采用結晶紫染色法檢測其生物被膜形成情況。最后采用酶標儀檢測各孔D595 nm值。生物被膜形成能力的判定標準為D595 nm≤0.31為無生物被膜形成菌株;0.31

2 結果與分析

2.1 細菌分離與染色

從58份病料中分離出14株RA，分離株在TSA培養基上，于燭缸中37 ℃培養24～36 h后，可形成圓形、略微突起、表面光滑的奶油狀小菌落（對著光線觀察菌落呈現淡藍色）。革蘭氏染色鏡檢可見散在或少數成對出現的革蘭陰性短桿（球桿）菌;瑞氏染色呈兩極濃染，符合RA的形態特征。

2.2 生化試驗結果

14株RA乳糖發酵試驗、半乳糖發酵試驗、甲基紅試驗、VP試驗、硫化氫產生試驗、硝酸鹽還原試驗和枸櫞酸鹽試驗均為陰性，不產生硫化氫，氧化酶試驗、觸酶試驗均為陽性，基本符合RA的生化特性。

2.3 16S rRNA基因和dan B基因PCR檢測結果

14株RA均能PCR擴增出約364、627 bp大小的條帶，與預期相符（圖1、圖2）。將陽性條帶切膠回收后測序，結果表明，擴增條帶的序列與目的基因序列高度一致。

2.4 血清型鑒定結果

將分離到的14株細菌分別與標準陽性血清進行平板凝集試驗。由表2可知，血清1型菌株3株、血清2型菌株4株、血清10型菌株2株， 其他菌株為未定血清型。

2.5 動物致病性試驗結果

試驗組櫻桃谷雛鴨接菌后18～24 h出現精神委頓、呆立，逐漸排出白色、黃白色、黃綠色稀糞，2～3 d后開始出現死亡，并在死亡前表現出陣發性搖頭、勾頭扭頸等臨床癥狀。剖檢死鴨有輕或重的纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎和腦膜炎。對死亡鴨進行細菌分離和PCR鑒定，結果能夠重新分離鑒定出接種菌。

2.6 14株鴨疫里默氏桿菌對11種抗菌藥物的耐藥表型

由表3可知，14株鴨疫里默氏桿菌對11種抗菌藥物表現出不同程度的耐藥，其中對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B、多西環素耐藥率較高，分別為100%（14/14）、100%（14/14）、85.72%（12/14）、85.72%（12/14）和78.58%（11/14）;對阿米卡星、鏈霉素和頭孢曲松敏感性較高，分別為92.86%（13/14）、64.28%（9/14）和57.14%（8/14）;多數菌株呈現多重耐藥現象（表2）。

2.7 分離株的生物被膜檢測

生物被膜檢測結果顯示，8株（PQJ4、PQY2、PQH5、LSG1、GSX6、HY8、HB1和HCH7）具有強生物被膜形成能力;GSP5和HY1為弱生物被膜形成能力，具體結果見表2。

3 結論與討論

信陽市水資源豐富，除采用標準化養殖體系的櫻桃谷肉鴨養殖龍頭——河南華英農業發展股份有限公司外，還有眾多小型養殖戶和散養戶。這些小型養殖戶和散養戶的鴨（鵝）苗來源比較雜，除本地的孵化場外，其他大多來源于江蘇、安徽、四川和廣東（獅頭鵝）等地，使得信陽地區鴨疫里默氏桿菌血清型分布較為多樣，再加上呼腸孤病毒感染的普遍存在[9-10]，使得鴨疫里默氏桿菌病的防控形勢更加嚴峻。

鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，并且存在明顯的區域性特征。任曉梅等從廣東、山東、江蘇等地區疑似鴨疫里默氏桿菌病病料中分離鑒定出46株鴨疫里默氏桿菌，其中血清1型、2型、10型和15型菌株依次為9株、25株、1株和1株，未定血清型菌株10株[4]。云水麗等從江蘇省某免疫鴨場的病死鴨中分離到了血清11型的鴨疫里默氏桿菌[11]。袁小遠等2015—2016年間從山東及河北等地的商品鴨場病料中共分離出18株鴨疫里默氏桿菌，均為血清1型RA[12]。本研究分離的14株鴨疫里默氏桿菌中血清1型菌株3株，血清2型菌株4株，血清10型2株，其他菌株為未定血清型，這與焦鳳超等的早期研究結果部分吻合[13]，這也解釋了為什么當前信陽地區很多養殖戶雖然實施了鴨疫里默氏桿菌病疫苗（主要是血清1型和2型）的免疫接種，但該病仍頻繁發生的原因。

由于鴨疫里默氏桿菌病疫苗免疫預防效果不佳，所以很多養殖戶往往采用抗菌藥物進行防治，而鴨疫里默氏桿菌又經常和大腸桿菌發生混合感染，這給該菌的分離鑒定帶來一定的難度。本研究參考丁云竹等建立的PCR方法輔助開展鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定，提高了工作效率[5]。另外Hu等建立的針對大腸桿菌phoA、沙門菌invA、鴨疫里默氏桿菌dna B基因的三重PCR方法，其檢測下限為1×103 CFU/mL[14]。Wei等建立的大腸桿菌、沙門菌、鴨疫里默氏桿菌、巴氏桿菌、多重PCR檢測方法，其檢測下限為10 pg基因組DNA[15]。以上這些方法有助于對臨床病料中的鴨疫里默氏桿菌進行鑒別檢測。

報道表明，RA對多種抗生素表現出耐藥現象[16]。荊雅瑋等對分離自安徽省的8株RA菌株藥物敏感性檢測結果表明，RA對阿莫西林、頭孢他啶和頭孢吡啶敏感，對洛美沙星和阿奇霉素、阿米卡星耐藥[17]。Zhong等對國內分離的224株RA進行耐藥性檢測的結果表明，50%的分離株對β-內酰胺類抗生素、利福平等多種抗生素耐藥，其中有4株對29種抗生素耐藥[18]。本次分離的14株RA對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B和多西環素表現出較高的耐藥率以及多重耐藥現象，但對阿米卡星敏感性較好，為92.86%（13/14），與上述結果有較大出入，這可能與各地用藥習慣有關。調查發現，信陽地區使用抗菌藥物防治鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病時，主要采用拌料或飲水給藥，且常使用氟苯尼考、強力霉素、阿莫西林、多黏菌素B和磺胺類等藥物，很少用阿米卡星和頭孢類藥物，這與14株RA的耐藥性檢測結果基本相符。

生物膜是一個微生物群落，由細胞外聚合物基質包圍的微生物組成。研究報道鴨疫里默氏桿菌形成生物被膜能力可能和該菌在養殖環境中的持續存在和細菌耐藥性存在一定的關系[8，19]。荊雅瑋等分離的8株菌株中有7株為強生物被膜形成株，且表明強生物被膜形成株AH-1對17種抗菌藥物耐藥[17]。本研究分離的14株RA中有8株為強生物被膜形成株，并且8株均表現出了多種耐藥現象，具體的機制有待于進一步研究確定。

綜上所述，本研究從58份臨床送檢病料中分離到14株疑似鴨疫里默氏桿菌，通過細菌生物學特性和16S rRNA基因、dan B基因PCR鑒定，確定分離菌株為鴨疫里默氏桿菌，并對其部分生物特性如血清型、耐藥表型和生物被膜形成能力進行了鑒定，為河南省信陽市的水禽鴨疫里默氏桿菌病的綜合防控提供參考。

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