番茄Mi-1基因調控元件及同源基因進化分析

劉子記 劉維俠 牛玉 楊衍

摘要：為闡明Mi-1基因轉錄調控元件及同源基因進化特點，從番茄品種京番308中克隆Mi-1基因起始密碼子上游序列，選取轉錄起始位點上游1 432 bp的序列進行啟動子順式調控元件分析，分析結果表明，Mi-1啟動子除了含有核心元件外，還含有光響應元件、脫落酸響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、低溫響應元件、防御與脅迫響應元件等。Mi-1同源基因進化分析結果表明，Mi-1同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。當同源指數為0.70時，番茄、馬鈴薯、辣椒中含有Mi-1同源基因，與辣椒相比，番茄與馬鈴薯的親緣關系更近。結果可為進一步研究 Mi-1基因的調控表達和進化規律奠定基礎。

關鍵詞：番茄;根結線蟲抗性;啟動子;同源基因;基因進化;順式調控元件

中圖分類號： S436.412文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0066-06

收稿日期：2019-09-20

基金項目：海南省科技項目（編號：ZDYF2018035）;中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項（編號：1630032017027）;農業農村部財政專項（編號：NFZX2018）。

作者簡介：劉子記（1982—），男，山東菏澤人，博士，副研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：liuziji1982@163.com。

通信作者：楊?衍，博士，研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：catasvegetable@163.com。

根結線蟲（Meloidogyne spp.）病是農作物最常見的病害之一，根結線蟲環境適應性強，在世界各地均有分布，寄生范圍廣，可侵染3 000多種植物[1]。南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲和北方根結線蟲是發生最為普遍的4種線蟲[2]。根結線蟲可造成作物減產10%～20%，嚴重時高達75%以上[3]。另外，根結線蟲還能與真菌和細菌形成復合侵染，加劇土傳病害的發生，造成更加嚴重的經濟損失[4-5]。據估計，世界范圍內每年由根結線蟲造成的損失超過1 200億美元[6]。

番茄（Solanum lycopersicum）是易感根結線蟲的作物，根結線蟲侵染番茄根系后，會造成番茄株高和產量顯著降低，果實品質變差[7-8]，已成為番茄產業發展的主要障礙[9]。以往防治根結線蟲主要采用輪作、化學防治等方法。輪作具有較大的局限性，在特定地區無法達到合理輪作的要求[10]。采用化學防治方法對土壤進行消毒，不僅會降低蔬菜品質，嚴重破壞土壤生態系統[11]，而且會導致線蟲抗藥性增強，蟲口密度上升[12]。培育抗病品種是防御番茄根結線蟲病最為經濟、有效的方法[13]。1956年Gibert研究發現，秘魯番茄對根結線蟲的抗性由1個顯性基因Mi控制，Mi基因被定位在番茄第6號染色體的短臂端[14]。Kaloshian等采用圖位克隆的方法從野生番茄中分離到Mi基因[15-16]。之后研究人員相繼發現了9個抗根結線蟲基因[17]，抗性位點Mi被表示為Mi-1。Mi-1基因是目前被開發利用最為廣泛的抗根結線蟲病基因[18]，能有效抵抗南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲3種主要根結線蟲的侵染[19]。植物對根結線蟲的抗性表現為過敏性反應，當根系受到根結線蟲侵染時，被侵染部位周圍的植物組織內發生細胞壞死，從而限制根結線蟲的取食和抑制其生長發育，最終致使根結線蟲死亡[20]。Mi-1基因抗性機制還有很多方面未被揭示，有關Mi-1啟動子特征和同源基因進化的研究鮮有報道。因此，本研究擬克隆Mi-1基因的上游啟動子序列，分析順式調控元件，另外，基于同源指數構建系統進化樹和基因進化折線圖，旨在為進一步闡明Mi-1抗性機制和促進其有效應用奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

供試材料為京番308，屬于粉果番茄雜交種，早熟，無限生長型，綠肩，果實圓形，每穗坐果數4～6個，單果質量80～120 g，耐裂性好，汁多味濃，具有Mi-1、Tm2a等基因位點，由北京市農林科學院蔬菜研究中心提供。試驗于2018年8月在中國熱帶農業科學院儋州試驗基地進行，將供試番茄種子播種于育苗盤中，待長至4葉1心時，摘取葉片，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[21]提取番茄材料的基因組DNA。

1.2?方法

1.2.1?Mi-1啟動子序列克隆

為了獲得Mi-1啟動子序列，參照GenBank中的Mi-1編碼序列AF039682和番茄基因組序列（https：//solgenomics.net/），根據Mi-1基因起始密碼子下游600 bp內的序列利用軟件Primer 5.0設計引物（正向引物序列5′→3′：CTGCAAAGTTTCTCCGCTTAT，反向引物序列5′→3′：CAAAATCGGAATAAGAAAGC），以京番308葉片基因組DNA為模板進行擴增，目的條帶的回收采用離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，將目的條帶進行連接、轉化，篩選3個陽性克隆，委托英韋創津生物科技有限公司進行測序。

PCR反應體系包括6 μL Premix TaqTM，150 ng模板DNA和1 μmol/L引物，添加ddH2O補足 10 μL。擴增程序為95 ℃預變性4 min;94 ℃變性50 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，40個循環;72 ℃ 終延伸 8 min;PCR產物最后于4 ℃下保存。取10 μL擴增產物與 2 μL Ultra Power DNA染料和2 μL上樣緩沖液混合均勻，經1%瓊脂糖凝膠電泳20 min后，顯色進行帶型分析。

1.2.2?Mi-1啟動子序列分析

Mi-1基因轉錄起始位點利用在線軟件FGENESH進行預測。Mi-1 啟動子順式調控元件利用P1antCARE[22]軟件進行預測。

1.2.3?Mi-1同源基因系統發育分析

首先通過BLASTP比對確定Gcorn數據庫中與Mi-1同源性較高的基因序列，結合BLASTP分析結果，計算基因對之間的同源性指數（HI）?；贖I值對同源基因進行分組，構建系統發育樹、基因進化折線圖和同源基因在物種相關網絡中的分布圖。

2?結果與分析

2.1?Mi-1基因啟動子克隆

為了獲得Mi-1啟動子序列，根據Mi-1起始密碼子下游600 bp內的序列利用軟件Primer 5.0設計引物，以京番308葉片基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得大小為2 045 bp的序列，經與 Mi-1 編碼序列比對發現，其位于1 523 bp處，起始密碼子ATG下游編碼序列與Mi-1編碼序列相匹配，說明所克隆序列為Mi-1基因上游啟動子序列。采用在線軟件FGENESH預測Mi-1轉錄起始位點位置，結果發現，轉錄起始位點位于1 435 bp處（A），位于起始密碼子上游338 bp處。選取轉錄起始位點上游1 432 bp序列進行啟動子區域順式作用元件預測。

2.2?Mi-1基因啟動子序列分析

利用P1antCARE軟件分析Mi-1基因啟動子序列，結果（圖1、表1）發現，Mi-1基因啟動子序列中存在多個順式作用元件。除了含有TATA-box、CAAT-box等核心元件外，還發現多個光響應元件，如AE-box、ATC-motif、Box 4、G-box、GATA-motif等;植物激素響應元件，如脫落酸響應元件ABRE;防御與脅迫響應元件，如TC-rich repeats;茉莉酸甲酯響應元件，如CGTCA-motif和TGACG-motif;低溫誘導元件，如LTR。預測結果說明，該啟動子的表達可能受光、脫落酸、逆境脅迫、低溫和茉莉酸甲酯等的誘導。

2.3?Mi-1同源基因進化樹構建

由于Gcorn數據庫無Mi-1基因序列，為了進行Mi-1同源基因進化分析，首先利用NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）基于Mi-1基因序列AF039682.1進行同源比對，結果顯示，與番茄XM_004240451.4的序列一致性最高，達9539%，XM_004240451.4對應的基因ID為101 244 292，對應的蛋白質ID為XP_004240499.1，利用XP_004240499.1基于Gcorn數據庫進一步開展 Mi-1 同源基因進化分析?；赬P_004240499.1和與其同源性最高的20條蛋白質序列構建Mi-1同源基因系統發育樹。結果（圖2）表明，XP_004240499.1 與番茄XP_010321826同源性最高，同源性指數為1.00，與潘那利番茄 XP_015078201 的同源性指數為0.93，與馬鈴薯 XP_015160128 的同源性指數為0.80，與辣椒 XP_016575993 的同源性指數為0.71。同源基因進化分析結果表明，番茄中Mi-1同源基因與馬鈴薯中Mi-1同源基因的親緣關系較近，其次為辣椒。

2.4?Mi-1同源基因進化分析

為了簡化系統發育樹的特征，構建Mi-1同源基因進化折線圖。當同源指數為1.00時，共包括2條蛋白序列，屬于旁系同源基因。同源指數為093時，潘那利番茄和普通番茄含有Mi-1的同源基因，同源基因屬于直系同源基因。同源指數為081時，

潘那利番茄、普通番茄和馬鈴薯含有Mi-1同源基因，同源基因屬于直系同源基因（圖3）。在物種相關網絡（圖4）中，節點代表物種，藍色節點代表該物種包含Mi-1的同源基因，當同源指數為0.70時，潘那利番茄、普通番茄、馬鈴薯、辣椒含有Mi-1的同源基因。綜上所述，茄科作物番茄、馬鈴薯和辣椒中含有Mi-1的同源基因，同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。

3?討論與結論

隨著保護地番茄栽培面積的增大以及復種指數的增加，根結線蟲危害日趨嚴重[23-24]。番茄Mi-1基因是目前被廣泛開發利用的抗根結線蟲病基因。Mi-1調控元件的不斷發現及同源基因系統進化的深入研究，將有助于揭示抗病基因在發揮抗性過程中的調控方式。啟動子含有轉錄起始所需的保守序列和RNA聚合酶特異性結合位點，是調控基因表達的重要組成部分。本研究選取番茄抗根結線蟲 Mi-1基因轉錄起始位點（TSS）上游1 432 bp的序列作為啟動子序列進行順式調控元件分析，分析結果顯示，該啟動子除含有CAAT-box和TATA-box等核心作用元件外，還含有多個光響應元件。

Tameling等研究發現，Mi-1具有結合和水解ATP的活性[25]。由于ATP是植物在有光條件下，通過光反應過程合成的，推測光對于誘導和調控 Mi-1 的基因表達具有重要作用。

另外，Mi-1啟動子區域還含有茉莉酸響應原件，這與Cooper等的研究結果[26]一致，Cooper等的研究結果表明，Mi-1介導的根結線蟲抗性在32 ℃時有所降低，茉莉酸處理可以增強高溫下Mi-1介導的根結線蟲抗性[26]。Mi-1啟動子區域含有脅迫響應元件，這與Guo等的研究結果[27]相吻合，Guo

等的研究表明，厭氧脅迫可以增強番茄材料的水楊酸信號通路[27]。水楊酸信號通路對于誘導Mi-1基因產生對根結線蟲的抗性具有重要作用[28]。另外，本研究還發現，Mi-1啟動子區域含有脫落酸響應元件，進一步推測Mi-1基因受激素和脅迫的誘導表達。

Mi-1同源基因系統進化分析結果表明，番茄、馬鈴薯和辣椒中存在多個Mi-1同源基因，尤其番茄中最多，這可能是由基因重復和基因轉換引起的，這與Segura等的研究結果[29-30]一致。番茄 Mi-1 同源基因編碼的蛋白XP_004240499.1與馬鈴薯Mi-1同源基因編碼蛋白的同源指數高于辣椒，進一步說明與辣椒相比，番茄與馬鈴薯的親緣關系更近，這與基于基因組序列構建的物種間相關關系一致（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy）。Mi-1 同源基因在潘那利番茄、普通番茄、馬鈴薯、辣椒中既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。這可能是由Mi-1同源基因在基因組上常成簇存在，基因拷貝間發生頻繁的序列交換引起的，這與Sanchez-Puerta等的研究結果[31]一致。本研究結果表明，Mi-1同源基因在茄科作物基因組進化過程中發生過多次基因復制與基因轉換事件。

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