小檗堿對皮膚鱗狀細胞癌裸鼠模型的抑制作用及其機制研究

邢天嬌 李東霞 張娟 賈敏鑫

1內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科，呼和浩特010050；2昆明醫科大學第一附屬醫院皮膚科650045

小檗堿是一種異喹啉類季銨生物堿，對多種腫瘤細胞有一定的抑制和殺傷作用，且毒性低、不良反應少，可用于治療多種癌癥［1?2］。本課題組前期體外實驗［3］已證實，小檗堿具有抑制皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cellcarcinoma，cSCC）細胞系A431增殖，促進其凋亡，抑制其遷移的作用。在此基礎上，我們建立cSCC?A431 裸鼠移植瘤模型，研究小檗堿對cSCC裸鼠移植瘤A431細胞增殖、凋亡的作用，探討其抗腫瘤作用，為cSCC 治療提供新線索。

材料與方法

一、細胞株及主要試劑和儀器

BALB/c?Foxn1nu雌性裸鼠20 只由南京大學模式動物研究所提供，實驗動物合格證號為201808257；本實驗在南京米度生物技術有限公司完成，動物使用許可證號為SYXK（蘇）2020?0016。A431 細胞購自中國科學院細胞庫（目錄號為TCHu188）。小檗堿粉末（美國Sigma?Aldrich公司）溶于蒸餾水，配成濃度為1 g/L。Tunnel 試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，貨號KGA704），反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司，貨號RR047A），Ki67 免疫組化試劑盒（丹麥Dako 公司，貨號K4003）。RPMI 1640 培養基，ECL 化學發光液（美國ThermoFisher 公司）；兔抗Bcl?2 抗體（美國Proteintech Group公司，貨號12789?1?AP）；兔抗Bax抗體、兔抗胱天蛋白酶（caspase）?3 抗體、鼠抗埃茲蛋白（Ezrin）抗體、兔抗Ki67 抗體（英國Abcam 公司，貨號分別為ab32503、ab44976、ab4069、ab16667）；辣根過氧化物酶（HRP）標記抗兔抗體、HRP抗小鼠抗體（上海碧云天生物技術有限公司，貨號分別為A0208、A0216）。StepOne Plus 定量PCR 儀（美國Applied Biosystems公司），Tanon5200化學發光檢測系統（上海天能科技有限公司）。

二、實驗方法

1.A431 細胞培養：A431 細胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基中，37 ℃、5%CO2恒溫培養箱內培養3 d，胰酶終消化后離心。1個培養皿細胞消化后，接種至3 個培養皿中進行細胞傳代培養。A431 細胞生長至80% ～90%時胰酶消化、離心，棄上清液，加培養基重懸后進行細胞擴大培養。胰酶消化，加磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，計數細胞，將密度調整至5×107個/ml。

2. cSCC?A431 裸鼠移植瘤模型的建立和分組處理：20只8周齡雌性裸鼠適應性飼養7 d，自由攝食，室溫26 ℃～28 ℃，相對濕度40%～50%。飼養7 d后，于每只裸鼠右背部皮下緩慢注射5×107個/ml細胞懸液100 μl，建立cSCC?A431 裸鼠移植瘤模型。接種第15天，腫瘤直徑約4 mm，將裸鼠隨機分為小檗堿低、中、高劑量組和對照組，每組5只，低、中、高劑量組分別于腹腔注射10、20、25 mg/kg小檗堿溶液，對照組注射等量生理氯化鈉溶液，每日1 次，連續給藥35 d，藥物劑量的確定參考預實驗及文獻［4］。分別于給藥前、給藥第7、14、21、28、35 d，采用LINKS 哈量電子游標卡尺測量腫瘤的最長徑（a，cm）與最短徑（b，cm），腫瘤體積（V，cm3）= a ×b2/2，并繪制體積變化曲線。35 d 實驗結束后處死裸鼠，取材，拍照后凍存。

3.標本收集：處死裸鼠后隨即手術剝離瘤塊稱重，腫瘤生長抑制率=［（對照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重］×100%。

4.瘤體組織病理檢查：4%甲醛溶液固定剝離的瘤體組織，制成石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。

5.免疫組化檢測小檗堿作用后移植瘤組織中Ki67 蛋白的表達：各組石蠟切片常規脫蠟脫水，PBS 沖洗3 次，置EDTA 緩沖液中微波修復，PBS 沖洗5 min 3 次；3%過氧化氫甲醇溶液阻斷內源性過氧化物酶10 min；PBS沖洗5 min 3次，甩干后5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min；棄BSA 液，滴加50 μl 稀釋的兔抗Ki67 抗體，4 ℃下過夜，PBS 沖洗5 min 3 次。去除PBS 液，滴加50 ～100 μl 抗兔二抗，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗5 min 3次；二氨基聯苯胺（DAB）溶液顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，脫水封片。光鏡觀察，染色為棕色細胞代表Ki67陽性，分別計數3 個200 倍視野Ki67 陽性細胞數并計算平均數，采用雙盲法判定計數，2 位有經驗的病理醫師反復核對。

6.TUNNEL染色檢測移植瘤組織中細胞凋亡：石蠟切片脫蠟至水，依次加入二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min、濃度梯度100%、85%、75%乙醇3 min，蒸餾水洗；接著加入蛋白酶K工作液在室溫下孵育30 min，PBS 洗片3 次，每次5 min；滴加TUNNEL 試劑盒內適量試劑1 末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）和試劑2 脫氧尿苷三磷酸（dUTP）按2∶29混合，37 ℃濕盒孵育2 h；PBS沖洗5 min 3次；滴加3%過氧化氫甲醇溶液，室溫避光孵育15 min；甩干切片，滴加適量熒光素抗體converter?POD，37 ℃溫箱孵育30 min，PBS 沖洗5 min 3 次；甩干后滴DAB顯色液，自來水沖洗切片終止顯色；蘇木素復染3 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化數秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗；最后用梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下拍照，采用上述免疫組化方法計數，棕黃色細胞核代表凋亡細胞，分別計數3 個200 倍視野凋亡細胞數并計算平均數。

7.熒光定量PCR 檢測cSCC?A431 裸鼠移植瘤中Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin mRNA 相對表達量：采用Trizol 法提取移植瘤組織總RNA，按反轉錄試劑盒說明書將RNA 反轉錄成cDNA，引物序列見表1。按熒光定量PCR試劑盒說明書配制溶液，反應體系為cDNA 2.0 μl、正反向引物各0.4 μl、SYBR Green solution 10.0 μl、滅菌雙蒸水7.2 μl，總量為20 μl；預變性95 ℃10 min；變性95 ℃5 s、退火、延伸60 ℃1 min，共40 個循環。采集數據進行分析，△Ct = Ct目的基因－Ct內參基因，△△Ct = △Ct小檗堿組－△Ct對照組，以2-△△Ct計算各基因mRNA相對表達。

8.Western 印跡法測定cSCC?A431裸鼠移植瘤中Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin 蛋白的表達量：液氮研磨各組腫瘤組織，冰上裂解，提取組織中總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進行蛋白定量。30 mg蛋白溶液中加入5×SDS 上樣緩沖液，至沸水中煮5 min，加足量電泳液，于濃縮膠中60 V 電泳30 min，樣品進入分離膠后，改用80 V電泳90 min。電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳，然后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；采用含5% BSA 的TBST 溶液按1∶1 000 稀釋Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin 一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min 3次；加1∶5 000 TBST溶液稀釋的二抗（HRP 抗小鼠抗體、HRP 抗兔抗體）室溫孵育2 h；TBST洗膜3次后，ECL化學發光，Tanon凝膠成像儀拍照，各蛋白的相對表達量為各蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值的比值。

基因名稱Bax Bcl?2胱天蛋白酶3埃滋蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶正向引物（5′→3′）序列GGATGCGTCCACCAAGAA GAACATTTCGGTGACTTCCG GACTGGAAAGCCGAAACTCT AGAGACGGTGGAGAGAGAAA GTGGCAAAGTGGAGATTGTTG Tm（℃）54.7 54.2 54.8 54.4 54.9反向引物（5′→3′）序列CATCCTCTGCAGCTCCATATT CCTGTTGATCATCCCTGGAG GTATCTTCTGGCAAGCCATCT CTTGGTCTTCTGCTCGTAGTC CGTTGAATTTGCCGTGAGTG Tm（℃）54.4 54.3 54.6 55.0 55.4

三、統計學處理

結果

一、小檗堿抑制cSCC?A431裸鼠移植瘤的生長

4 組cSCC 裸鼠腫瘤生長曲線見圖1。隨小檗堿劑量升高和作用時間延長，腫瘤生長曲線逐漸變平緩。與對照組相比，各小檗堿組腫瘤生長受到不同程度的抑制，其中高劑量組腫瘤生長抑制作用最明顯。用藥第35 天，低、中、高劑量組瘤體積顯著低于對照組（t = 3.08、6.81、7.38，均P < 0.01），見表2。4 組移植瘤重量差異有統計學意義（P <0.01），且各小檗堿組瘤重均顯著低于對照組（t =4.07、6.33、7.26，均P<0.01）。見圖2、表2。小檗堿低、中、高劑量組腫瘤生長抑制率分別為31.05%、66.68%、76.49%。

二、不同劑量小檗堿處理后cSCC?A431裸鼠移植瘤的組織病理表現

對照組cSCC?A431 裸鼠移植瘤組織見大量鱗狀細胞腫瘤團塊，細胞異形性明顯，可見核分裂相及瘤巨細胞，細胞間橋消失，腫瘤細胞無壞死或少量點狀壞死（圖3）；小檗堿低劑量組腫瘤細胞團間壞死灶較分散，呈點狀分布，中劑量組腫瘤細胞團之間可見灶性壞死區域，高劑量組腫瘤細胞團之間出現大片狀壞死（圖3）。高劑量組腫瘤壞死的范圍、程度最大。

三、免疫組化法檢測不同劑量小檗堿處理后cSCC?A431裸鼠移植瘤中Ki67蛋白的表達

瘤體積（mm3）697.48±107.49 480.91±139.57a 218.80±116.45a 179.11±69.14a 23.84<0.01瘤重（g）0.55±0.15 0.31±0.06a 0.18±0.07a 0.13±0.05a 20.91<0.01 Ki67陽性細胞數（200倍視野）93.33±7.09 67.33±5.69a 34.33±7.02a 23.00±5.29a 76.79<0.01組別對照組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組F值P值凋亡細胞數（200倍視野）17.33±4.73 27.67±3.79b 39.00±3.00a 41.67±3.06a 27.27<0.01

對照組可見大量表達Ki67 的棕色A431 細胞，而加入小檗堿處理后，隨劑量增加，Ki67 陽性細胞減少。見圖4。小檗堿低、中、高劑量組Ki67 陽性細胞數均顯著低于對照組（t=5.03、11.43、13.62，均P<0.01），見表2。

四、TUNNEL 法檢測小檗堿處理后cSCC?A431裸鼠移植瘤中細胞凋亡

對照組瘤組織中棕黃色陽性細胞少，染色淺；而加入小檗堿處理后，隨其劑量增加，凋亡細胞逐漸增多，染色深。見圖5。小檗堿低、中、高劑量組凋亡細胞數均顯著高于對照組（t=3.41、7.16、8.04，P<0.05或<0.01），見表2。

五、熒光定量PCR檢測小檗堿對cSCC?A431裸鼠移植瘤中Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin mRNA表達的影響

組別mRNA相對表達（2-△△Ct）Bax 1.00±0.00 1.25±0.36 1.66±0.40 2.38±0.33a 10.96<0.01 Bcl?2 1.00±0.00 0.74±0.05a 0.50±0.01a 0.36±0.06a 146.39<0.01 caspase?3 1.00±0.00 1.35±0.07 2.01±0.19b 2.86±0.72a 14.12<0.01 Ezrin 1.00±0.00 1.20±0.32 1.46±0.24 2.33±0.07a 25.01<0.01對照組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組F值P值蛋白相對表達（以GAPDH為內參）Bax 0.33±0.06 0.59±0.06a 0.93±0.09a 1.01±0.06a 59.60<0.01 Bcl?2 1.02±0.03 0.90±0.03 0.64±0.08a 0.42±0.12a 34.81<0.01 caspase?3 0.29±0.05 0.61±0.07a 0.93±0.07a 0.98±0.09a 59.02<0.01 Ezrin 1.02±0.07 0.76±0.06a 0.55±0.03a 0.39±0.05a 74.58<0.01

4 組Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin mRNA 的表達差異均有統計學意義（均P < 0.01）。見表3。其中，小檗堿高劑量組Bax和Ezrin mRNA表達顯著高于對照組（t=5.36、8.02，均P<0.01），而小檗堿低、中劑量組與對照組比較差異無統計學意義（均P>0.05）。小檗堿中、高劑量組caspase?3 mRNA的表達均顯著高于對照組（t = 3.30、6.04，P < 0.05或<0.01），而小檗堿低劑量組與對照組差異無統計學意義（P>0.05）。此外，小檗堿低、中、高劑量組Bcl?2 mRNA 的表達均顯著低于對照組（t = 7.76、15.20、19.43，均P<0.01）。

六、Western 印跡法測定不同劑量小檗堿處理后cSCC?A431 裸鼠移植瘤組織中Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin蛋白的表達

隨小檗堿劑量的增加，Bax、caspase?3蛋白表達逐漸增加，而Bcl?2 蛋白、Ezrin 蛋白表達逐漸降低。見圖6、表3。小檗堿低、中、高劑量組Bax、caspase?3 蛋白表達量均顯著高于對照組（Bax：t =4.37、10.32、11.80；caspase?3：t=5.41、10.87、11.69；均P<0.01），而Ezrin 蛋白的表達均顯著低于對照組（t = 5.88、10.67、14.06，均P < 0.01）；小檗堿中、高劑量組Bcl?2 蛋白的表達均顯著低于對照組（t=5.86、9.34，均P<0.01），而小檗堿低劑量組與對照組差異無統計學意義（P>0.05）。

討論

近年小檗堿的抗腫瘤作用在多種腫瘤研究中獲較大突破。本研究采用cSCC A431 細胞裸鼠移植瘤模型探究小檗堿抗cSCC 機制。與對照組相比，10、20、25 mg/kg 小檗堿對cSCC?A431 移植瘤生長均有不同程度的抑制作用，隨小檗堿劑量的增加，移植瘤生長逐漸變緩，腫瘤生長抑制率增高。組織病理檢查顯示，隨小檗堿劑量的增加，腫瘤細胞壞死逐漸增多，高劑量組腫瘤細胞壞死面積更廣泛。Ki67與細胞有絲分裂相關，在增殖活躍的腫瘤細胞中高表達，因此常作為多種腫瘤細胞增殖的標志物［5］。免疫組化顯示，隨小檗堿劑量的增加，Ki67表達逐漸降低，提示小檗堿可抑制cSCC?A431移植瘤細胞增殖。TUNNEL實驗顯示，低、中、高劑量小檗堿均能促進cSCC?A431 移植瘤細胞凋亡。本文結果與前期小檗堿對A431 體外研究結果相符［3］。

惡性腫瘤的發生、發展與諸多因素相關，細胞凋亡能力的異常降低與增殖能力的異常增強是其關鍵因素之一，而小檗堿與多種惡性腫瘤細胞的凋亡與增殖有關［6］。Bcl?2 和Bax 是細胞凋亡研究中最受重視的2 個癌基因，其中大多數Bcl?2 家族蛋白位于哺乳動物的線粒體外膜上，可通過調節線粒體通透性來調控細胞凋亡［7］。Bax 作為Bcl?2 家族成員之一，其生理作用與Bcl?2相反，表現為促進細胞凋亡［8］。caspase 是細胞程序性死亡信號網的重要部分，細胞凋亡過程中caspase?3 的激活受上游Bcl?2因子調控，而小檗堿可誘導Bcl?2家族成員活化，導致線粒體膜電位及通透性改變，促使相關蛋白酶活化，使線粒體釋放細胞色素C 等，導致caspase 級聯反應激活，尤其激活反應關鍵酶caspase?3，從而引發凋亡［9?10］。本研究顯示，低、中、高劑量小檗堿處理后cSCC?A431 裸鼠移植瘤中凋亡相關蛋白Bax、caspase?3 mRNA 和蛋白相對表達有不同程度的增加，而Bcl?2 mRNA 和蛋白相對表達有不同程度的降低，其中小檗堿高劑量組Bax、caspase?3、Bcl?2 mRNA 和蛋白相對表達與對照組差異均有統計學意義。

Ezrin 蛋白具有參與細胞膜的連接，維持細胞形態，調節細胞運動等，且與腫瘤的侵襲與轉移密切相關［11］。Ezrin蛋白作為連接細胞膜與細胞骨架的重要分子，通過相應氨基酸載體與Fas 結合［12］，使Ezrin 蛋白從細胞膜易位到細胞質中，同時伴隨Ezrin蛋白的去磷酸化［13］，導致Ezrin蛋白失活，最終誘發凋亡［14］。本研究中，小檗堿高劑量組Ezrin mRNA相對表達顯著高于對照組，而低、中、高劑量組Ezrin蛋白表達卻顯著低于對照組。Ezrin mRNA表達結果與預期不同，且與其蛋白表達結果不一致，分析其原因：①mRNA 轉錄、加工、翻譯形成蛋白過程復雜，中間微小環節偏差均可導致結果不同；②轉錄與翻譯存在時間間隔，檢測時間點不同，轉錄水平與翻譯水平可能存在差異；③mRNA是單鏈結構，相對不穩定，且熒光定量PCR靈敏度高，應進一步增加實驗次數以排除實驗誤差。

綜上所述，小檗堿通過抑制cSCC?A431移植瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡，進而有效抑制cSCC?A431移植瘤生長，其機制可能與小檗堿下調Bcl?2、Ezrin表達，同時上調Bax、caspase?3的表達有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突