金花葵花粗黃酮對自然衰老小鼠抗氧化的影響

王元 梁澤華 崔明勛

摘 要：為了探究金花葵花粗黃酮對動物體衰老的生理影響，采用有機回流的方法對金花葵干花進行分級萃取，選取黃酮含量較高的乙酸乙酯提取層和正丁醇提取層作為藥物，研究其對自然衰老小鼠抗氧化的影響。將50只（210±5）d的昆明小鼠隨機分為5組，每組10只，包括乙酸乙酯提取物高、低劑量組，正丁醇提取物高、低劑量組、衰老對照組，并通過灌胃進行給藥處理。其中，乙酸乙酯提取物高、低劑量組灌胃給藥劑量分別為5mg/kg、2mg/kg，正丁醇提取物高、低劑量組給藥劑量分別為30mg/kg、15mg/kg，另將6只35d的昆明小鼠作為年輕對照組，衰老對照組灌胃同體積的蒸餾水。給藥30d后處死采樣，測定小鼠的紅細胞膜唾液酸含量（SA）、腦脂褐素含量，肝、腎的超氧化物歧化酶活力（SOD）、丙二醛含量（MDA）。結果表明：與衰老對照組相比，乙酸乙酯提取物組的紅細胞膜SA含量水平升高（P<0.01，P<0.05）、肝、腎SOD活力提高（P<0.01）、腦脂褐素含量水平降低（P<0.01）、肝和腎MDA含量水平降低（P<0.01或P<0.05），而正丁醇層提取物對小鼠均無明顯的效果。說明金花葵花粗黃酮提取物中乙酸乙酯層提取物使老齡小鼠抗氧化體系活力提高，并且其脂質過氧化物有所減少，具有一定的抗氧化作用。

關鍵詞：金花葵黃酮;衰老;唾液酸;超氧化物歧化酶;丙二醛;脂褐素

中圖分類號 R285.5文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）19-0025-04

Effect of Flavonoid Extracts from Flowers of Hibiscus Manihot in Aging Mice

WANG Yuan# LIANG Zehua# et al.

（College of Agronomy， Yanbian University， Yanji 133002， China）

Abstract：To study effect of flavonoid extracts from flowers of hibiscus manihot on Aging mice，in this paper，extracting the flowers of hibiscus manihot by organic solvents，and choosing the ethyl acetate and butyl alcohol extracts as drops，which contents the higher levels of flavonoid，and the aging KM mice were chosen as test object.7 monthly healthy KM mice were divided into 5 group：normal aging group，ethyl acetate extract low and high dosage group，butyl alcohol extract low and high dosage group，with 10 mice in each group，and 6 young mice were chosen as the young contral group ;the mice in each group were administrated by gavage with ethyl acetate extract low and high dosage group（2mg/kg，5mg/kg），and butyl alcohol extract low and high dosage group（15mg/kg，30mg/kg ），and the aging contral group were gavaged with water.30 days later，the mice were killed to detect the content of sialic acid （SA）on red cell，lipofuscin of brain tissues，and the content of malondialdehyde（MDA）and the activity of superoxide dismutase（SOD ）in liver and kidney.Compared with the control groups ，the ethyl acetate extracts can significantly increase the content of SA（P<0.01 or P<0.05），and in the liver and kidney，the distinction of SOD activity in the ethyl acetate extracts groups bears significance in statistics（P<0.01），while the levels of MDA and lipofuscins deposition are lower（P<0.01 or P<0.05）.But the butyl alcohol extracts has no effects in aging mice，showing that the ethyl acetate extracts can delay the senility on mice by enhancing antioxidation and reduce the contents of lipid peroxide.

Key words：Hibiscus Manihot Flavonoid; Aging; Sialic acid（SA）; Superoxide dismutase（SOD）; Malondialdehyde（MDA）; Lipofuscin

金花葵（Hibiscus manihot L.）為一年生草本錦葵科秋葵屬植物，是一種瀕臨絕種植物，又名菜芙蓉或野芙蓉、黏干或山榆皮，在食用、藥用、保健方面的價值極高。近年來，許多學者對金花葵進行了各方面的研究，表明其主要活性成分為黃酮類物質，其中金花葵干花總黃酮含量最高[1-2]，比銀杏、大豆等高數十倍，是植物界天然黃酮含量較高的品種[3]。黃酮類物質近年來受到了廣泛的關注，有許多研究表明其良好的抗氧化能力。例如，秦晶晶等[4]對菟絲子中提取黃酮，發現黃酮在體外實驗中對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基，羥自由基和超氧陰離子又具有一定的清除作用;丁婷婷等[5]對刺玫葉總黃酮進行研究，通過對衰老模型昆明鼠不同給藥劑量的黃酮處理，檢測血清中細胞因子及各組織臟器抗氧化酶的變化，得出刺玫葉總黃酮具有延緩衰老的作用。

目前，以自然衰老小鼠為對象，進行金花葵粗黃酮體內試驗，觀察肝腎等臟器的研究卻鮮有報道。為此，本研究通過對自然衰老小鼠進行不同劑量金花葵粗黃酮灌胃給藥，觀測小鼠肝、腎組織中超氧化物歧化酶活力（SOD）、丙二醛（MDA）、紅細胞唾液酸（SA）以及腦脂褐素含量的變化，探討金花葵粗黃酮抗氧化損傷、抗衰老效果，為金花葵黃酮抗衰老功效的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 金花葵干花：采于延邊大學農學院;56只昆明小鼠，其中50只為平均日齡在（210±5）d健康雌性昆明小鼠，體重為（41±4）g，另外6只為日齡為35d健康的昆明小鼠，是延邊大學生化實驗室近交繁殖系，標準飼料飼養，室溫20～25℃。

無水乙醇;石油醚;氯仿;乙酸乙酯;正戊醇;甲醇;正丁醇;乙酸;濃鹽酸;氫氧化鈉;硝酸鋁;氯化鈉;亞硝酸鈉;聯苯三酚;FeCl3;3，5-二羥基甲苯;硫代巴比妥酸;SDS（十二烷基硫酸鈉）;硫酸奎寧;考馬斯亮藍G-250（分析純）：國藥集團藥業股份有限公司。

722S紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司;FA1004A電子分析天平：上海精天電子儀器有限公司;旋轉蒸發器RE-5299：鞏義市英峪高科儀器廠;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司;DFY-5/10低溫冷卻液反應?。红柫x市予華儀器有限責任公司;超純水系統：Millipore公司;CT15RT臺式高速冷凍離心機：中國天美科學儀器有限公司;DK-8D型電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司;FD-1D-50冷凍干燥箱：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金花葵干花粗黃酮的提取 干花經過60℃低溫烘干6h，粉碎、過60目篩，按照1∶35料液比加入70%乙醇，抽提3次，得到金花葵乙醇粗提物，用石油醚進行脫脂，蒸干有機溶劑后凍干，取上述凍干物，分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行充分萃取，旋轉蒸發濃縮后凍干，得到不同萃取層的金花葵干花粗黃酮，用標準曲線法測定其黃酮含量[6]。在金花葵干花粗黃酮中，乙酸乙酯層干燥提取物黃酮含量約為63.73%，正丁醇層約為46.49%。

1.2.2 試驗分組及給藥處理 50只（210±5）d的健康雌性昆明小鼠，按隨機取樣的方式分成5組，每組10只，分別為：自然衰老對照組、乙酸乙酯提取物高劑量組、乙酸乙酯提取物低劑量組、正丁醇提取物高劑量組和正丁醇提取物低劑量組，另有6只35d的昆明小鼠作年輕對照組。適應環境飼養7d后，年輕和衰老對照組灌胃等體積的雙蒸水，乙酸乙酯提取物高、低劑量組分別按照5mg/（kg·d）、2mg/（kg·d）的劑量灌胃乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物高、低劑量組分別按照30mg/（kg·d）、15mg/（kg·d）的劑量灌胃正丁醇提取物。另取6只平均日齡為（35±1）d的小鼠作為年輕對照組。給藥組連續灌胃30d，各組小鼠自由進食和水，每7d記錄1次體重。

1.2.3 采血取樣及指標測定 灌胃30d后，摘眼球取血，低溫保存于含有抗凝劑的離心管中。脫頸處死小鼠后，低溫條件下，取肝、腎組織約0.1g左右，加入1mL生理鹽水用高速勻漿器以15000r/min的條件下研磨制成10%組織勻漿液，離心后避開脂肪層，取清液進行指標測定。

1.2.3.1 唾液酸含量 Bialsche比色法：Bialsche試劑組成為0.1g3.5-二羥基甲苯;40.7mL濃鹽酸（12mol）;1mL 1%FeCl3溶液;8.3mL雙蒸水;血影蛋白溶液的制備：小鼠眼球采血于抗凝管，加入1mL預冷生理鹽水，于4℃下3000r/min離心10min，洗滌3次。加入0.05mol/L pH=8.4的磷酸鹽緩沖液1mL，低溫溶脹1h，加入磷酸鹽緩沖液，于4℃下3000r/min離心20min，吸棄上清液，重復洗滌3次。加入300μL磷酸鹽緩沖液，制成血影蛋白溶液。取100μL血影蛋白溶液于1.5mL離心管中，加入生理鹽水、Bialsche試劑各100μL，震蕩混勻，沸水浴12min，冰浴3min，加入正戊醇600μL，搖勻，5000r/min，離心4min，取上清液，于569nm波長下，以空白管調零，測定吸光度值[7]。

1.2.3.2 脂褐素[6] 取一半腦組織，稱重記錄，加入1.5mL氯仿-甲醇溶液（2∶1）研磨，然后8 000r/min離心10min，取上清液，以360nm波長為激發波長，在420nm波長下測定上清液吸光度值。

1.2.3.3 SOD活力 聯苯三酚自氧化法[8]：將0.1molpH=8.3的磷酸鹽緩沖液加熱至29℃，然后放在電熱毯上進行保溫。向比色杯中加入2.95mL的緩沖液，再加入適量的聯苯三酚，快速蓋上玻璃紙，開始上下顛倒混勻的同時按下30s的計時器。30s的時候讀取340nm波長下的吸光度。再過30s后再次讀數，共計6次。計算間隔1min的OD差值的平均值A0，調整聯苯三酚的使用量A0使接近0.07，記錄聯苯三酚的量為BmL。向比色杯中加入2.95mL的緩沖液和0.02mL臟器勻漿上清液和聯苯三酚BmL，記錄340nm波長下的吸光度，計算間隔1min的OD差值的平均值為A1。SOD活力值計算公式如下：

SOD活力值（U/mL）：（A0-A1）/A0*2*（2.95+B+0.02）/0.02

1.2.3.4 MDA含量 硫代巴比妥酸法[9]：取0.06mL臟器組織勻漿上清液，先加入0.03mL8.1%SDS溶液和0.2mL DW振蕩10min，再加0.3mL的0.2mol/L的乙酸和0.3mL 1%TBA，混勻后放入100℃水浴20min，水浴結束后8000r/min離心10min，然后以空白管調零在532nm處測吸光度。

1.2.3.5 蛋白質含量 考馬斯亮藍法[10]：取適量標準血清蛋白溶液加1mL考馬斯亮藍溶液測595nm波長的吸光度值做成標準曲線，另取等量的臟器組織勻漿上清液重復上述操作測595nm波長的吸光度值，以標準曲線來計算臟器組織勻漿上清液中的單位蛋白含量。

1.3 數據處理 經SPSS 22.0統計軟件以及Excel對試驗所得數據統計，各指標以x±s表示，對各組進行t檢驗比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 各組小鼠臟器指數 由表1可知，肝、腎、腦、心、脾的臟器指數均為年輕對照組最大。與年輕對照組相比，衰老對照組肝、腦、心的臟器指數出現極顯著地偏低（P<0.01）。與衰老對照組相比，各給藥組均未出現統計學上的顯著性差異。

2.2 各組小鼠紅細胞膜中SA和腦脂褐素含量 由表2可知，SA含量中，與年輕對照組相比，衰老對照組SA含量有偏低趨勢，但未出現顯著性差異。與衰老對照組相比較，乙酸乙酯提取物高、低劑量組紅細胞SA含量均顯著升高（P<0.01或P<0.05），正丁醇提取物高、低劑量組SA含量略未出現顯著性差異。腦脂褐素含量結果：與年輕對照組相比，衰老對照組腦脂褐素含量顯著性升高（P<0.05）。與衰老對照組相比較，乙酸乙酯提取物高、低劑量組腦脂褐素含量極顯著降低（P<0.01），且高劑量組低于低劑量組，正丁醇提取物高、低劑量組腦脂褐素含量未見明顯變化。

2.3 各組小鼠肝、腎的SOD、MDA變化 由表3可知，在肝臟的指標中，與年輕對照組相比，衰老對照組SOD活力顯著性升高（P<0.05），MDA均極顯著升高（P<0.01）。與衰老對照組相比，乙酸乙酯提取物低劑量組SOD活力極顯著升高（P<0.01），MDA含量降低，但未出現顯著性差異，乙酸乙酯提取物高劑量組SOD活力未見明顯變化，MDA降低，但未出現顯著性差異。正丁醇提取物高、低劑量組SOD、MDA未見明顯變化。在腎臟指標中：與年輕對照組相比，衰老對照組SOD活力顯著性降低（P<0.01），MDA極顯著性升高（P<0.01），與衰老對照組相比，各給藥組SOD活力未見顯著性差異，乙酸乙酯提取物高、低劑量組MDA含量極顯著降低（P<0.01）。

3 結論與討論

黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，廣泛存在于各類植物中，因其繁多的種類和復雜而獨特的化學結構造成了它對哺乳動物和其他類別的細胞具有各種各樣的生理、生化作用[11]。黃酮類化合物是多種中草藥的有效活性成分，如黃芩、銀杏、沙棘等，而且在其他植物中均有發現。而金花葵其中主要成分是黃酮類化合物，許多藥理研究證明其藥用價值[2-3]。仇燕等[12]應用菜芙蓉（金花葵）花80%乙醇提取物，進行體外抗氧化實驗，證明其對DPPH、·OH、[O-2]·自由基的清除能力高于VC，且具有隨總黃酮質量濃度增加而上升的趨勢。雷波等[13]，對SD大鼠進行不同劑量金花葵總黃酮灌胃給藥，得出金花葵總黃酮能夠提高大鼠皮膚中SOD活性，提高谷胱甘肽（GSH）、羥脯氨酸（HYP）含量，可能具有延緩皮膚衰老的功效。因此，以金花葵黃酮為研究對象，探究其抗衰老、抗氧化功效的研究非常必要。本研究用不同萃取層的金花葵黃酮灌胃給自然衰老的老齡昆明鼠，觀察小鼠體內各生化指標情況來判斷小鼠的抗氧化情況，進而判斷其效果。

衰老的自由基學說的理論認為，機體隨著年齡增長的退行性變化是由于自由基物質過剩造成氧化損傷的結果。機體自身有一整套平衡自由基體系，如果這體系無法維持自由基平衡，就會導致機體在內外環境因素和抗氧化酶活力下降的情況下使自由基過剩進而造成一定程度的細胞毒性和不可逆損傷[14]。機體內的氧化代謝過程會產生對細胞有毒副作用的氧自由基，也叫活性氧（ROS），它們能夠通過一系列有害的生化反應來破壞細胞體。而在對應的防御體系中，SOD發揮了重要作用。SOD是一種抗氧化金屬酶，是生物體中抗氧化酶體系的重要成員，能通過歧化反應消除機體內的[O-2]·，保護機體并消除氧化損傷，減緩衰老[15]。MDA是生物體內由于自由基與脂質發生過氧化作用而生成的產物，會導致蛋白質等大分子發生交聯，還能加劇膜損傷引起細胞衰老[16]。脂褐素是溶酶體不能消化的物質，是由一些電子密度不等的小泡、脂滴等沉積于溶酶體后形成的殘余體，隨年齡增長在體內蓄積，是衰老的重要指標之一。腦脂褐素含量反映腦組織脂質過氧化強度和速度，從而反映出衰老程度，其值越高衰老程度越高[17]。SA與細胞代謝旺盛程度密切相關，具有促進細胞轉移，抑制細胞凋亡的作用，紅細胞膜SA降低，會引起膜結構異常，細胞破裂，數量減少，其中紅細胞膜表面SA含量隨細胞老化逐漸下降[18]。

金花葵花乙酸乙酯提取層黃酮能有效提高紅細胞膜SA含量，肝、腎SOD活性，降低腦脂褐素含量，降低肝、腎MDA含量，具有較好的抗氧化、抗衰老效果，但金花葵正丁醇提取層黃酮上述效果均不明顯。在本試驗中，臟器指數這項指標顯示，年輕小鼠各臟器指數均較衰老組偏大，該現象可能由于隨年齡增長，器官產生了退行性變化，或由于年老小鼠基礎代謝率下降，能量囤積造成臟器指數相對減小現象。指標測定結果表明，金花葵花乙酸乙酯提取層黃酮的抗氧化效果未見明顯劑量效應，最適給藥劑量有待進一步研究。此外，在肝臟SOD活性指標中，衰老組活性高于年輕組，發生這種情況的原因，是否由于肝臟作為解毒器官，年輕小鼠體內氧自由基含量少、其他抗氧化酶活性也很強，體內積累有害物質相對少，對SOD的需求不如衰老小鼠高。關于以上的問題還有待進一步研究探討。

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（責編：張宏民）