發酵乳桿菌發酵人參工藝優化及人參皂苷抗氧化活性測定

屈青松 林 峰 趙崇妍 馬 濤 宋 帥 史新元?

（1.北京中醫藥大學， 北京100029； 2.江蘇菌鑰生命科技發展有限公司， 江蘇 鹽城224000）

乳酸菌是有較高認可度的益生菌［1］，廣泛應用于農業、食品加工等行業中［2］，例如常用于酸奶、泡菜等發酵食品中［3］。大量研究表明，乳酸菌能調節腸道菌群，改善胃腸道功能，降低血液中的膽固醇水平［4］。此外，乳酸菌能產多種酶類，如超氧化物歧化酶、β?葡萄糖苷酶、α?淀粉酶、纖維素酶等［5］，各種產酶乳酸菌已經用于生產之中［6］，其中發酵乳桿菌被CFDA 認定為可用于食品生產的益生菌，有較高的安全性［7］。

人參為五加科多年生草本植物，2012 年衛生部批準其（5 年及5 年以下人工種植的）作為新資源食品?，F代醫學證明人參具有諸多生物活性功能［8］，不僅抗癌、抗衰老、抗氧化［9］，還有效改善機體的免疫調節系統［10］。但目前國內市售人參產品形式單一，以藥物為主，在食品領域的應用并不廣泛［11］，因而生產系列產品，如飲料、保健茶等具有廣闊前景［12］。

利用益生菌發酵中草藥現已成為研究熱點［13］。本實驗以發酵乳桿菌作為發酵菌種，以益生菌的活菌數為檢測指標，在單因素試驗基礎上利用響應面法優化發酵工藝，HPLC 法分析益生菌發酵后人參皂苷含有量和SOD 活性變化，以期為人參發酵研究和深層次開發積累資料。

1 材料

1.1 試劑與藥物 人參、發酵乳桿菌Lactobacillus fermentium購自江蘇菌鑰生命科技發展有限公司；人參皂苷Rg1（貨 號 X13O8L45573）、人參皂 苷 Re（貨 號B10M8S35243）、人參皂苷Rb1（貨號Z16J9X52719）、人參皂苷Rc（貨號M18J9S53098）、人參皂苷Rd（貨號Z13N8X48155）購自上海源葉生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶采用T?SOD 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；MRS 液體培養基購自青島海博生物科技有限公司。

MRS 液體培養基由蛋白胨10 g、牛肉浸粉8 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二胺2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.04 g、吐溫?80 1 g、蒸餾水1 L 組成。調節pH 為6.0～6.2，121 ℃下滅菌15 min。MRS 固體培養基在MRS 液體培養基內添加20 g 瓊脂／L。

1.2 儀器 BXM?30R 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）；潔凈工作臺（上海匯龍儀表電子有限責任公司）；AR1502CN 精密電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；XW?80A 微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；DL?820E 智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；SHZ?95A 循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

2 方法

2.1 工藝流程 選用3～5 年干參，經過打粉處理后過藥典四號篩，人參粉末以去離子水混懸后制備為勻漿，高壓蒸汽法進行滅菌，溫度為121 ℃，時間為20 min，冷卻后接種一定量，采用MRS 液體培養基制備的發酵乳桿菌種子液，在28 ℃下進行發酵，達到發酵終點時停止，即得，冷藏保存。

2.2 活菌計數 無菌條件下將發酵液梯度稀釋至不同濃度，涂布于MRS 固體培養基中，28 ℃下培養36 h，選擇菌落數在30～300 個的平板進行計數，每個梯度重復3 次。

2.3 單因素試驗 以發酵時間16 h、人參與水料液比1 ∶20、發酵溫度36 ℃、接種量2%、搖床轉速160 r／min 為初始發酵條件，分別考察發酵時間（4、8、12、16、20、24、48、72 h）、人參添加量（1%、2%、4%、6%、8%、10%、12.5%、20%）、發酵溫度（24、28、32、36、40 ℃）、乳酸菌接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）對乳酸菌活菌數的影響。

2.4 響應面優化 依據單因素試驗結果，以人參添加量、發酵時間、溫度、接種量為因素，以活菌數為響應值對發酵工藝進行優化。因素水平見表1。

表1 因素水平

2.5 人參皂苷轉化分析

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 對照品3.75、3.00、3.50、2.50、5.95 mg，溶于甲醇中，定容至5 mL，即得。

2.5.2 線性關系考察 精密吸取對照品溶液，甲醇稀釋100、50、20、10、5、2 倍，各進樣10 μL 測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行線性回歸。

2.5.3 樣品處理 取發酵液勻漿與相同濃度的人參勻漿，冷凍干燥處理，取粉末0.30 g，置于具塞三角瓶中，加80%甲醇25 mL，密塞后稱定質量，搖勻，超聲（250 W、50 kHz）提取1 h，離心收集上清，沉淀以相同條件提取2次，收集上清，揮干后甲醇溶解并定容至10 mL，溶液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.5.4 色譜條件 安捷倫 Eclipse XDB?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.05 mol／L磷酸二氫鉀（B），梯度洗脫（0～10 min，20% A；10～22 min，20%～22% A；22～30 min，22%～29% A；30～50 min，29%～29% A；50～60 min，29%～35% A；60～65 min，35%～40% A；65～75 min，40%～30% A；75～85 min，30%～20%A；85～90 min，20%～80%A）；體積流量1 mL／min；柱 溫30 ℃；檢測波 長203 nm；進樣量10 μL；分析時間90 min。

2.6 SOD 活性檢測 取發酵液，12 000 r／min 離心30 min后取上清，過0.22 μm 濾膜，得澄清發酵液，未發酵人參勻漿以相同操作方法制得，MRS 益生菌發酵液在相同發酵條件下以MRS 液體培養基發酵后，離心取上清制得。取上述母液，用去離子水制成不同質量分數的樣品溶液（1%、5%、10%、20%、50%、100%），利用T?SOD 試劑盒測定不同濃度溶液的SOD 活性。

3 結果

3.1 發酵時間對活菌數影響 乳酸菌在初始發酵條件下72 h 內的生長曲線見圖1A。由此可知，36 h 為乳酸菌生長的最佳時間，活菌數可達3.5×109CFU／mL，因此選擇24～48 h 作為發酵時間區間。

3.2 人參添加量對活菌數影響 由圖1B 可知，人參的最佳添加量為8%，活菌數為8.2×109CFU／mL，因此選擇人參添加量6%～10%為添加量區間。

3.3 發酵溫度對活菌數影響 不同溫度對乳酸菌生長的影響見圖1C。由此可知，發酵最適溫度為28 ℃，活菌數為4.5×1012CFU／mL，因此選擇24～32 ℃為發酵溫度區間。

3.4 乳酸菌接種量對活菌數影響 乳酸菌接種量對乳酸菌生長的影響見圖1D。由此可知，乳酸菌的最佳添加量為3%，活菌數為2.3×1013CFU／mL，因此選擇2%～4% 作為接種量區間。

圖1 不同條件對乳酸菌活菌數的影響

3.5 Box?Behnken 設計 根據單因素試驗結果確定因子的水平范圍，以活菌數Y作為響應值，進行4 因素3 水平的響應面分析（表2），方差分析見表3。

應用Design Expert 6.0.5 軟件對表2 數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程為Y＝394.20＋0.81A-2.17B＋9.83C-27.75D-8.33AB＋3.25AC-68.50AD-4.42BC-13.08BD-10.50CD-74.74A2-215.12B2-180.29C2-1.58D2。

該方程的相關系數R2為0.952 3，說明模型擬合程度良好，可用分析和預測。由表3 可知，該模型的F＝12.010，P＜0.05，較顯著；失擬項P＝0.362＞0.05，不顯著；調整復相關系數RAdj2 ＝0.904 7，說明該模型能解釋約90%響應值的變化，擬合程度較好。

由回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型中一次項D（接種量）極顯著，A（發酵時間）、B（人參添加量）、C（溫度）影響不顯著；二次項A2、B2、C2均處于極顯著水平，說明其對響應值影響大；交互項AD處于顯著水平，說明發酵時間和接種量之間存在交互作用，并且對活菌數影響較大。

由二元回歸方程繪制響應面分析圖，見圖2。最終確定，最優工藝為發酵時間4 h，人參添加量8.03%，溫度28.24 ℃，接種量2%，乳酸菌 活菌數 為4.372 × 1013CFU／mL。

3.6 驗證試驗 利用優化條件進行3 批試驗，測得乳酸菌活菌數的 平均值 為 4.5 × 1013CFU／mL，與預測 值4.372×103CFU／mL相比無顯著差異，表明模型可靠，有一定的實用價值。

同時，優化后的活菌數（4.5×1013CFU／mL）比優化前（2.3×1013CFU／mL）提高了1.95 倍，說明所確定的優化方案合理有效，能夠顯著提高乳酸菌的生長情況。

3.7 HPLC 分析 經乳酸菌發酵后，發酵體系中各人參皂苷含有量均有一定的提高（表4），其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd 分別提高了69%、62%、73%、34%、64%，成分6 增加了約2 倍，并且經發酵后產生了新成分7。人參皂苷的線性關系考察結果見表5，可知在各自范圍內線性關系良好。

3.8 SOD 活性測定 隨著溶液質量分數增加，發酵后的人參勻漿上清SOD 活性從29.9 U／mL 上升到51.0 U／mL，并且在50%～100%時從40.5 U／mL 提升至51.0 U／mL，升高約26%。此外，MRS 益生菌發酵液也存在一定的SOD 活性，但與人參發酵液相比較低。見圖3。

4 討論

近年來，利用益生菌對人參進行發酵越來越受到人們的關注［14］，本文利用響應面法優化乳酸菌在人參中發酵的最佳條件優化后最佳發酵條件為發酵時間42 h，人參添加量8.03%，溫度28.24 ℃，接種量2%，乳酸菌活菌數為4.372×1013CFU／mL，且經過驗證，優化結果可靠。

人參皂苷是人參的主要功能性成分［15］，利用微生物的葡萄糖苷酶的去糖基化作用，可將其轉化為生理和藥理活性更強的稀有人參皂苷［14］。經HPLC 分析發現，經發酵后幾種人參皂苷含有量均有一定程度的上升，其原因可能為①發酵乳桿菌產生的某些纖維素酶水解了人參木質部細胞的細胞壁，從而提高人參皂苷提取率，導致人參皂苷含有量增加；②發酵乳桿菌可能產生連接酶，從而將已被水解的糖苷重新連接成新的單體皂苷，導致人參皂苷含有量增加，具體還需進一步研究。

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析

圖2 各因素響應面圖

表4 發酵前后人參皂苷的變化

表5 人參皂苷線性關系

微生物及其酶的去糖基化作用可將人參皂苷轉化為生理、藥理活性更強的稀有品種。本實驗發現，在發酵前后人參有新物質峰產生，表明發酵乳桿菌中可能存在某些酶類，可對人參皂苷進行轉化。

SOD 可對抗與阻斷氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞［16］。SOD 活性實驗發現，經發酵后發酵液其活性有一定的提升，說明在發酵時乳酸菌中多種酶類發揮作用，并可能釋放一些對人體有益的酶類（如SOD 等）。

綜上所述，本實驗以發酵乳桿菌為發酵菌株，其安全可靠，對人體健康十分有益，在食品生產加工、臨床醫療等領域已經得到廣泛關注。人參被稱為“百草之王”，在抗腫瘤、提高機體免疫力、改善記憶、延緩衰老等方面具有很好的療效，乳酸菌發酵該藥材有較高的應用價值，可為其深加工奠定基礎。

圖3 SOD 活性測定結果