6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導的HK?2 腎小管上皮細胞損傷的保護作用

邵珠瑩 潘金火 張月嬋 蔣志濤 王 雪 馮星月 王建春?

（1.南京中醫藥大學藥學院， 江蘇 南京210023； 2.南京中醫藥大學附屬張家港醫院， 江蘇省企業研究生工作站， 江蘇 張家港215600）

關木通含馬兜鈴酸，20 世紀90 年代，國內外一些學者報道顯示，應用關木通可導致以進展性腎小管間質損傷為主的腎毒性，國家藥監局于2003 年取消了關木通的藥用標準［1?3］。但馬兜鈴酸A 作為馬兜鈴屬和細辛屬植物中所共有的成分，在很多常用的中藥中都含有，馬兜鈴、青木香、天仙藤、細辛、尋骨風、朱砂蓮、廣防己等［4］，這些中藥臨床應用廣泛，所以一味地禁用或者全面否定并不是解決這些藥物臨床應用的最佳方法。在古代醫藥文獻中藥物毒性常是指這種藥物的偏性，在中醫理論看來，作為藥物都有毒性，關鍵是要正確使用。筆者的前期研究報道顯示［5］，UPLC?TQD?MS 法基于“辛開苦降” 理論探討關木通配伍干姜的減毒存效機制，前期的結果顯示干姜?關木通（2 ∶1）配伍煎煮后，關木通中的馬兜鈴酸A 降低率達87.79%，而配伍后的方劑對大鼠的利尿作用沒有影響，且對大鼠急性腎功能損傷明顯低于關木通生品。

干姜作為常用的藥食同源中藥材，據 《本草綱目》《本草經疏》 等記載，其性熱，有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲等功效［6］。6?姜酚是干姜中的主要有效成分，研究發現其有抗炎、抗腫瘤、抗氧化以及降壓等作用［7］。為了驗證藥物配伍后對關木通的腎臟減毒作用，為含馬兜鈴酸A 的中藥飲片現有臨床應用問題提供一定的指導，本實驗在體外觀察比較了馬兜鈴酸A 和6?姜酚＋馬兜鈴酸A 對正常人腎小管上皮細胞HK?2 的影響。

1 材料

1.1 細胞 人正常腎小管上皮細胞（HK?2 細胞，批號20180322），購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑與藥物 馬兜鈴酸A（批號PRF8010623）、6?姜酚（批號PRF8012005）購自上海源葉生物科技有限公司（純度＞98%）；DMEM 培養基（以色列Biological Industries公司，批號171115?374）；胎牛血清（以色列Biological In?dustries 公司，批號Nu12955）；0.25% 胰蛋白酶（以色列Biological Industries 公司，批號J340823）；雙抗混合液（青霉素、鏈霉素，以色列Biological Industries 公司，批號170218?385）；熒光素二乙酸酯（阿拉丁試劑有限公司，批號201804）；SOD 試劑盒、MDA 試劑盒、GSH 試劑盒、GSH?Px 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20180234、20180626、20180321、20180422 ）；GAPDH Rabbit IgG（美國Santa Cruz 公司，批號A6765）；Rabbit polyclonal to NF?kB p65（英 國 Abcam 公 司，批 號GR568343?1）；Rabbit polyclonal to p?NF?kB p65（英 國Abcam 公 司，批 號 GR530813?2 ）；Caspase?3 Rabbit polyclonal IgG（美 國 Bioworld 公 司，批 號 CJ54654）；Cleaved?Caspase?3 Rabbit polyclonal IgG（美 國Bioworld 公司，批號JJ761202）。其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器 MicroCL 17R 高速低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ELx800 酶標儀（美國伯騰儀器公司）；DMI3000B 倒置光學顯微 鏡（德國徠卡公司）；Master?D UVF 超純水機（上海和泰儀器有限公司）；SK?O180?E 圓形搖床（大龍醫療設備有限公司）；EPS300 電泳電源、VE?180 垂直電泳槽、5300 凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；FS?500 封口儀（德清拜杰電氣有限公司）。

2 方法

2.1 HK?2 細胞的培養 細胞置含10%胎牛血清的DMEM完全培養液中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，按生長狀況用胰酶消化后，換液傳代培養，取4～6 代用于后續實驗。

2.2 馬兜鈴酸A 處理HK?2 細胞 精密稱取馬兜鈴酸A 對照品適量，DMEM 培養液溶解稀釋，得到40、20、10、5、1 μg／mL 對照品溶液，使用前用0.22 μm 微孔濾膜過濾。

將HK?2 細胞以5×105／mL 濃度接種于96 孔板中，每孔100 μL。實驗分組為0（正常組）、1、5、10、20、40 μg／mL馬兜鈴酸A 組，每組10 個復孔，培養24 h，各孔加入CCK?8 試劑20 μL，繼續培養4 h 后，在450 nm 波長下用酶標儀測定光密度（OD），計算細胞存活率，空白孔每孔加入200 μL DMEM 培養液，細胞存活率＝［（OD藥物組-OD空白孔）／（OD正常組?OD空白孔）］×100%。

2.3 6?姜酚處理損傷的HK?2 細胞 精密稱取6?姜酚對照品適量，用DMEM 培養液溶解并進行稀釋，得到300、200、100、50 μg／mL 對照品溶液，使用前用0.22 μm 微孔濾膜過濾。

4～6 代HK?2 細胞用細胞計數板計數后，以DMEM 培養液稀釋細胞，細胞濃度約為5×105／mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，24 h 細胞孵育貼壁后，棄去原培養液。將細胞分為正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（50、100、200、300 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）共處理組，每組10 個復孔，培養48 h 后每孔加入20 μL CCK?8 試劑，培養箱內繼續培養4 h，在450 nm 波長下用酶標儀測定光密度（OD），確定6?姜酚最佳濃度。

2.4 FDA 活細胞熒光染色觀察細胞形態 將細胞分為正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（200 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）組，將細胞孵育完畢后，用移液槍棄去孔中的培養基。5 mg FDA 溶解于1 mL 丙酮，作為FDA／丙酮母液（5 mg／mL），PBS（1 ∶ 1 000）稀釋 成10 μg／mL FDA／PBS 溶液，各孔加入200 μL 孵育10 min，棄去孔中液體，再加入PBS 緩沖液200 μL，5 min 后棄液，再加入PBS 緩沖液200 μL，倒置熒光顯微鏡于488 nm 波長處激發熒光并拍照。

2.5 Hoechst 熒光染色觀察細胞凋亡 將細胞分為正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（200 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）組，將細胞孵育完畢后，用移液器棄去孔中的培養基，各孔加入細胞固定液200 μL，固定10 min后棄固定液，各孔以200 μL PBS 緩沖液清洗3 次，棄所有液體，加入200 μL Hoechst 染色液，5 min 后棄染色液，各孔以200 μL PBS 緩沖液清洗3 次，最后1 次清洗后不丟棄上清液，倒置熒光顯微鏡于350 nm 波長處激發熒光并拍照。

2.6 吸光度法檢測細胞上清SOD、MDA、GSH 和GSH?Px水平 將細胞分為正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（200 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）組，孵育完畢后收集各孔上清液，按照SOD、MDA、GSH 和GSH?Px檢測試劑盒的說明書，分光光度計測定吸光度，計算各組酶活性。

2.7 Western blot 檢測蛋白表達 4～6 代HK?2 細胞計數后，DMEM 培養液稀釋至細胞濃度約為1×106／mL，接種于6 孔板，每孔1 mL，12 h 細胞孵育貼壁后棄液。設正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（200 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）組，每組設置6 個復孔，共3 組，各組加入含有對應藥物的培養基2 mL，對照組加入DMEM 單培2 mL，培養48 h，細胞刮剝離細胞，收集至EP 管，裂解細胞并離心收集上清后，Bradford 法進行蛋白定量，蛋白變性后取等量總蛋白進行SDS?PAGE 電泳，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF 膜，封閉液封閉2 h，分離PVDF 膜，分開孵育GAPDH（1 ∶4 000）和NF?κB p65（1 ∶1 000）、p?NF?κB p65（1 ∶1 000）、caspase?3（1 ∶1 000）、cleaved?caspase?3（1 ∶1 000）抗體，4 ℃過夜后清膜3 次，兔二抗（1 ∶10 000）孵育2 h 后清洗膜3 次，凝膠成像體統化學發光成像。

2.8 統計學分析 熒光圖片數據應用Image pro plus 軟件計數，Western blot 數據應用Quatity one 軟件統計灰度值，計量數據用（）表示，結果用Graph Pad Prism 5.0 軟件進行方差分析和作圖，多組間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 馬兜鈴酸A 對HK?2 細胞活性影響 與正常組相比，馬兜鈴酸A（5～40 μg／mL）降低HK?2 細胞存活率（P＜0.01），且呈濃度依賴性（表1）；5 μg／mL 馬兜鈴酸A 組細胞存活率接近75%，20、40 μg／mL 馬兜鈴酸A 組細胞損傷太強，死亡太多，故選定10 μg／mL 馬兜鈴酸A 來刺激細胞。

表1 不同質量濃度馬兜鈴酸A 對HK?2 細胞存活率的影響（， n＝10）

表1 不同質量濃度馬兜鈴酸A 對HK?2 細胞存活率的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01。

3.2 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導的HK?2 細胞存活率的影響 與正常組對比，10 μg／mL 馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞存活率降低（P＜0.01）；不同濃度6?姜酚處理后，HK?2 細胞凋存活率有不同程度的升高，在200 μg／mL 時最高，達到72%左右，故選取200 μg／mL。見表2。

表2 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導的HK?2 細胞存活率的影響（， n＝10）

表2 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導的HK?2 細胞存活率的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01。

3.3 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導的HK?2 細胞形態的影響 與正常組相比，馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞數目減少；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞數目增加。正常組細胞形態清晰，細胞體積飽滿，細胞之間聯系緊密；給藥組細胞稍固縮，細胞間分散；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞間分散度較小，飽滿細胞的數目較多。見圖1。

圖1 各組HK?2 細胞形態（×100）

3.4 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導的HK?2 細胞凋亡的影響 正常組HK?2 細胞幾乎無凋亡，細胞核無分裂固縮形態；與正常組相比，馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞凋亡率升高（P＜0.01）；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞凋亡率降低（P＜0.01）。見表3、圖2。

表3 各組HK?2 細胞凋亡率（， n＝10）

表3 各組HK?2 細胞凋亡率（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與馬兜鈴酸A 組比較，＃＃P＜0.01。

圖2 各組HK?2 細胞凋亡（×100）

3.5 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導的HK?2 細胞上清液中酶的影響 與正常組相比，馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞上清液中MDA、GSH?Px 水平升高（P＜0.01），SOD、GSH 水平降低（P＜0.01）；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞上清液中MDA、GSH?Px 水平降低（P＜0.01），SOD、GSH 水平升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組HK?2 細胞上清液中酶水平（， n＝10）

表4 各組HK?2 細胞上清液中酶水平（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與馬兜鈴酸A 組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導的HK?2 細胞蛋白表達的影響 與正常組相比，馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞中p?NF?κB p65、cleaved?capase?3 蛋白表達升高（P＜0.01）；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞中p?NF?κB p65、Cleaved?Capase?3 蛋白表達降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組HK?2 細胞中蛋白表達（×100）

4 討論

關木通曾在臨床被廣泛應用，在大量研究人員報道了其腎毒性后被限制使用。課題組早年對關木通進行了系統的綜述［8］，詳細總結了關木通的化學成分、藥理學研究、臨床應用及毒理學研究。既往研究也顯示，關木通的不同炮制品中的馬兜鈴酸A 的含有量差異顯著，且馬兜鈴酸A的水平與炮制品對大鼠腎臟功能的損傷有相關性［9?10］。

吳建紅等［11］研究了導赤散配伍關木通對人腎小管上皮細胞周期的影響。陳燕玲等［12］通過6?姜酚保護由丙酮醛損傷的HK?2 細胞，發現6?姜酚具有保護HK?2 細胞減輕受損傷程度的作用。本研究結果顯示，與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組夠顯著升高HK?2 細胞的活性，改善細胞的形態，減少細胞凋亡的數目，降低細胞上清液中MDA 和GSH?Px 的水平，并增強上清液中SOD 和GSH 水平，降低HK?2 細胞內p?NF?κB p65 和Cleaved?Capase?3 蛋白表達，表明6?姜酚可能通過提高HK?2 細胞的抗氧化應激能力及抑制NF?κB 介導的炎癥通路對抗馬兜鈴酸A 引起的HK?2 細胞損傷。由此表明，在使用含馬兜鈴酸的中藥時，可給予干姜或其有效成分以降低患病風險，從而為關木通臨床應用提供理論依據。