基于網絡藥理學探究三物白散治療胃癌的機制

楚毓博 濮文淵 楊青青 唐存祥 周春祥?

（1.南京中醫藥大學中醫學院·中西醫結合學院，江蘇 南京210000； 2.長興縣中醫院， 浙江 湖州313100）

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，雖然實施根除幽門螺桿菌等預防措施使得胃癌的發病率和死亡率呈下降趨勢［1］，但其仍是引起生活負擔的重要疾病，因此，早期診斷、明確機制、積極治療當為重中之重。除了手術及化療外，中醫藥的多成分、多靶點、多通路特色使其在胃癌治療中的價值越來越顯著［2］。

三物白散出自《傷寒論》，由巴豆、貝母、桔梗三味中藥組成，主治寒實結胸證；現代藥理學研究表明巴豆有抗多種腫瘤作用［3］，貝母有抗炎、耐缺氧、抗腫瘤、抗潰瘍等作用［4］，桔梗有抗腫瘤、抗氧化活性、免疫調節等作用［5］；本課題組前期致力于其作用機制研究，發現該方能有效抑制胃癌細胞增殖，阻滯胃癌細胞周期以誘導凋亡，下調胃癌細胞釋放相關免疫抑制因子，誘導免疫細胞活化增殖，釋放相關細胞免疫正相調節因子，拮抗胃癌細胞多藥耐藥，防止腫瘤的復發轉移等［6］?；诒菊n題組前期研究及相關藥理學研究，三物白散抗腫瘤的作用已明確，但具體的分子作用機制仍須深入研究。因此，本文運用網絡藥理學探討三物白散治療胃癌的分子作用機制，以利于之后的系統性研究。

1 方法

1.1 三物白散活性成分及靶標蛋白篩選 利用TCMSP 數據庫平 臺（http：／ ／ibts.hkbu.edu.hk／LSP／tcmsp.php）［7］，分別以“巴豆” “貝母” “桔?！?為關鍵詞檢索藥物的活性成分及靶標蛋白?？诜锢枚龋∣B）是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）中最重要的藥動學參數之一，它表示口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達體循環并被吸收的速度與程度，OB 值越高通常表示藥物的生物活性分子的類藥性（DL）越好［8］。因此，以OB≥30%、DL≥0.18 的過濾條件篩選出三物白散的活性成分。利用UniProt（https：／ ／www.uniprot.org／）數據庫查詢靶標蛋白對應的基因名。以往的研究表明許多藥物活性成分的OB 值是小于30% 的，因此，結合BATMAN?TCM 數據庫（http：／ ／bionet.ncpsb.org／batman?tcm／）［9］，以P＜0.05、Score cutoff≥48 的條件篩選三物白散活性成分。結合文獻中雖未納入以上標準但已報道有顯著藥理作用的活性成分，將三者結果合并，建立三物白散活性成分?靶點數據庫。

1.2 構建活性成分?靶點網絡 將活性成分?靶基因導入Cytoscape 軟件，構建活性成分?靶點網絡。

1.3 胃癌靶點及復方?疾病靶點的獲取 利用GEO 數據庫（GSE118916）、OMIM 數據庫（https：／ ／www.omim.org／）、Genecards 數據庫（https：／ ／www.genecards.org／），獲得胃癌相關靶基因，韋恩圖取交集，得到三物白散作用于胃癌的靶基因。

1.4 蛋白相互作用網絡（PPI）的構建 將靶基因導入String 網站（https：／ ／string?db.org／），設置物種為“Homo spanies”，獲得PPI 網絡圖，并利用R 軟件獲得網絡中的關鍵基因。

1.5 分子對接 配體選擇三物白散中巴豆苷、佛波醇、β?谷甾醇、貝母乙素、貝母甲素、桔梗皂苷、遠志皂苷、桔梗酸等15 個主要成分，受體選擇上一步得到的前30 個關鍵靶點中有較多實驗研究基礎的12 個靶點，進行分子對接。所有受體由PDB 官網下載，所有的配體小分子由chemdraw 及chem3d 產生。首先對受體進行預處理，包括氨基酸殘基的修復、加氫加電荷、選擇力場、刪除不必要的水分子以及能量最小化，然后對配體進行能量最小化處理，選擇基于配體?受體結合能力的打分函數ASE 進行評估，得到每個化合物與受體的對接打分值，對接打分值越小，配體與受體的結合越牢固。

1.6 靶基因的GO、KEGG 通路、蛋白互作網絡及模塊分析 將靶基因導入Metascape 在線分析工具（http：／ ／metascape.org／gp／index.html＃／main／step1），設置物種為人，進行GO、KEGG 分析、蛋白互作網絡及模塊分析，保存分析結果。

2 結果

2.1 三物白散活性成分及活性成分?靶點網絡 經TCMSP、BATMAN?TCM 結合文獻中已報道具有明確藥理活性的藥物，篩選并去除重復值后，獲得三物白散活性成分46 個（表1），其中巴豆14 個，主要包括巴豆苷、巴豆酸、佛波醇及酯類等；桔梗21 個，主要包括桔梗皂苷、遠志皂苷、桔梗酸、遠志酸等；貝母14 個，主要包括貝母甲素、貝母乙素、貝母新堿、浙貝素等。巴豆中的佛波醇、12?O?癸基佛波醇?13?（2?甲基丁酸酯）雖未入選標準，但大量研究表明其具有明顯的藥理活性，因此被納入候選成分，桔梗中的遠志酸，桔梗酸A、B、C，槲皮素?7?O?葡萄糖苷，槲皮素?7?O?蕓香糖苷，五沒食子酰葡萄糖，槲皮素?7?O?葡萄糖苷，槲皮素?7?O?蕓香糖苷易被氧化成槲皮素，五沒食子酰葡萄糖易被氧化成沒食子酸；浙貝母中的貝母甲素、貝母乙素也被納入候選成分。相關靶點387 個（去重前454個），其中巴豆194 個，貝母128 個，桔梗132 個（三藥合并去重后387 個）。將上述成分、靶點導入Cytoscape3.7.1軟件構建活性成分?靶點網絡圖（圖1），共有433 個節點，46 個紅色節點為活性成分，387 個綠色節點為靶點，667條邊代表活性成分對靶點的作用，體現了三物白散多成分、多靶點的特點。

2.2 胃癌靶點及復方?疾病靶點 多疾病靶點數據庫篩選獲得胃癌相關靶基因9 536 個，與387 個藥物靶基因取交集，共得三物白散作用于胃癌的靶基因289 個（圖2）。

2.3 PPI 網絡及Hub 基因 將289 個靶基因導入String 網站，置信度設置為大于0.4，結果如圖3，共289 個節點，3 761 條邊，說明靶基因之間互作關系密切。將.tsv 文件保存，利用R 軟件獲取網絡中的關鍵基因，繪制度值最大的前30 個靶點的柱狀圖（圖4，橫坐標代表基因的度值），這些基因在三物白散發揮作用過程中起著核心作用，保存結果以用于后續的分子對接分析。

圖1 活性成分?靶點網絡

圖2 三物白散作用于胃癌的靶基因

圖3 蛋白互作網絡

表1 三物白散活性成分信息

圖4 關鍵基因

2.4 分子對接 分子對接結果打分值越小，配體與受體的結合越牢固。由表2 數據可以看出，三物白散主要成分與關鍵靶點的結合程度均較好，其中TNF、PPARG、CASP3、VEGFA、MMP9 的結合程度最為牢固，為后續的網絡分析奠定了基礎。

2.5 靶基因GO、KEGG 通路分析 靶基因GO、KEGG 通路分析結果如圖5。GO 分析結果（圖5A）表明激素水平調節、血液循環的調節、脂質代謝調節、對脂多糖、有毒物質、酸性化學物質、氮化合物等的反應、細胞凋亡等過程均在三物白散治療胃癌的過程中發揮著重要的作用；KEGG 通路分析結果（圖5B）表明癌癥通路、凋亡、TNF信號通路、鉑耐藥、脂肪細胞因子信號通路、HIF?1 信號通路、PPAR 信號通路、cAMP 信號通路、JAK?STAT 信號通路、自噬等均在三物白散治療胃癌的過程中發揮重要作用，其中，富集最為顯著的是癌癥通路（表3、圖6）。上述結果表明三物白散活性成分靶點分布于不同的生物過程和通路，可干預不同的過程及通路協調發揮作用，體現了中藥復方多成分、多靶點、多途徑的作用特點。

表2 分子對接結果

圖5 GO、KEGG 通路分析

表3 KEGG 通路富集信息

圖6 癌癥通路

2.6 靶基因蛋白互作及模塊分析 Metascape［10］中的蛋白互作及模塊分析結果見圖7。該網絡通過BioGrid6，InWeb_ IM7，OmniPath8 數據庫的蛋白互作富集分析所得，網絡包含與靶基因列表中至少一個其他成員形成物理相互作用的蛋白質子集，如果網絡包含3～500 種蛋白質，則應用MCODE 算法9 來識別密集連接的網絡組件。為靶基因列表確定的MCODE 網絡共涉及8 個模塊，這些模塊中的基因可能在三物白散治療中發揮更重要的作用。

圖7 蛋白互作及模塊分析可視化

模塊1 主要與細胞對有機環狀化合物的反應有關，涉及通路包括癌癥通路、鉑耐藥；模塊2 主要與腺苷酸環化酶調節性G 蛋白偶聯受體有關，涉及通路包括神經活性配體?受體相互作用、cGMP?PKG 信號通路、鈣信號通路；模塊3 主要與細胞骨架的結構成分、氧化還原酶活性、醛脫氫酶（NAD）活性有關，涉及通路包括、間隙連接、吞噬體；模塊5 主要與組蛋白脫乙?；附Y合、染色質結合有關，涉及通路包括內分泌抵抗、癌癥相關通路有關；模塊6主要與腺苷酸環化酶激活G 蛋白偶聯受體信號通路、cAMP介導的信號傳導、環核苷酸介導的信號傳導有關，涉及神經活性配體?受體相互作用等過程；模塊7 主要與延遲的整流鉀通道活動、電壓門控鉀通道復合物、電壓門控鉀通道活性有關；模塊8 主要與醇脫氫酶活性，鋅依賴性、酒精脫氫酶（NAD）活性、乙醇氧化有關，涉及酪氨酸代謝、脂肪酸降解、視黃醇代謝等過程。已有研究表明揮發性有機化合物［11］可導致組織內強烈的氧化應激反應，與正常組織相比，胃癌組織中的含量明顯失調，氧化反應使體內各種自由基活性增加、細胞免疫力下降、細胞間隙聯接交通受阻；G 蛋白偶聯受體［12］與胃癌的發展、侵襲與轉移等多種惡性生物學過程密切相關；組蛋白異常乙?；?3］促進胃癌的發展，其抑制劑可在體外抑制癌細胞的生長、分化等；現有研究［14］證明胃癌細胞膜上確實存在延遲整流鉀離子通道，并通過影響細胞膜電壓、改變細胞體積等方式影響著腫瘤細胞的增殖和周期。cGMP?PKG 信號通路、鈣信號通路、cAMP 信號通路等均為胃癌研究的明星通路，且cGMP?PKG 信號通路與鉑耐藥、內分泌抵抗均參與胃癌的多藥耐藥過程，提示三物白散在胃癌多藥耐藥的過程中可能發揮了重要的作用。

3 討論

胃癌治療對于放、化療方法存在較強的耐藥性和副作用，在給患者帶來重大生活負擔和精神折磨的同時，生存率并沒有得到顯著性提高［15］。中醫藥治療胃癌已有上千年的歷史，其多成分、多靶點的特色在胃癌治療中的地位越來越顯著，但是中醫藥治療胃癌的具體機制尚有很多不明之處，長期運用配伍相似或相同的處方，極有可能出現中藥耐藥的現象［16］。因此，明確中藥治療胃癌的具體機制，既可達到精準醫療的要求以提高臨床療效，又可盡可能避免中藥耐藥現象，是為當前研究中醫藥治療腫瘤的重中之重。

三物白散是《傷寒論》 溫下逐邪之代表方，用于治療寒實結胸證。傷寒大家陳亦人教授運用該方加味方康爾愛片治療中晚期胃癌多例，效果顯著。相關臨床報道表明三物白散加味用于治療肺癌并發胸水［17］。朱懷平等［18］運用三物白散加味方治療進展期胃癌，結果表明其可提高瘤體穩定率，降低惡化率，提高患者生活質量。趙志英等［19］研究發現三物白散抑制腫瘤細胞分泌免疫抑制因子，改善機體免疫功能。徐力等［20］研究發現三物白散加味方通過影響細胞周期以影響細胞增殖。凌云等［21］研究發現三物白散可逆轉胃癌耐藥細胞株SGC7901 ／DDP 多藥耐藥，其作用機制可能是通過抑制P?gp 功能而實現的。大量的臨床及基礎研究奠定了該方治療癌癥的地位。

通過網絡藥理學分析得出三物白散活性成分46 個，包括β?谷甾醇、巴豆苷、巴豆酸、花生四烯酸、刺槐素、木犀草素、桔梗皂苷、遠志皂苷、桔梗酸、遠志酸樺木醇、貝母甲素、貝母乙素、鬼臼毒素等。其中β?谷甾醇具有抗炎、抑制腫瘤、免疫調節、抗氧化等作用［22?24］。巴豆苷可抑制癌細胞生長且促進其凋亡，相關研究［25］表明其可抑制MV4?11 細胞內HDACs 信號通路和FLT3 信號通路的相關蛋白表達，從而產生抗白血病作用。巴豆酸和花生四烯酸屬于不飽和脂肪酸，相關研究［26］指出其可抑制癌細胞增殖，同時促進凋亡。刺槐素能靶向RARγ，通過RARγ 調控P53?AKT 信號通路發揮抗腫瘤作用［27］，亦可抑制p?NF?κB、下調COX?2 表達，繼而上調促凋亡蛋白Bax 表達、下調抗凋亡蛋白Bcl?2 表達促進細胞凋亡［28］。木犀草素可抑制自噬以強化細胞對順鉑的敏感性［29］。桔梗皂苷具有祛痰、抗炎、抗氧化活性、抗腫瘤等［5］作用。遠志皂苷可通過調節Caspase 家族因子活性誘導A549 細胞凋亡。樺木醇可誘導Caspase?3、Caspase?9 參與細胞凋亡［30］。貝母甲素、貝母乙素和鬼臼毒素均可發揮抗腫瘤作用，貝母甲素下調L?RP 蛋白（肺耐藥相關蛋白）表達、抑制ERCC1mRNA 表達，逆轉腫瘤多藥耐藥，貝母乙素主要與自噬、上皮間質轉化相關［31?32］。綜上，三物白散的活性成分在抗炎、抗腫瘤、免疫調節等方面均可發揮一定的作用，為其治療癌癥提供了物質基礎。

基因富集結果表明三物白散治療胃癌涉及激素水平調節、血循環的調節、脂質代謝、酶活性、自噬等過程，富集的通路主要集中在癌癥、凋亡、缺氧、代謝與炎癥相關通路。腫瘤微環境具有局部組織缺氧、免疫炎性反應等特點。缺氧微環境［33?34］可導致腫瘤的增殖、血管生成、轉移及耐藥性。HIF?1α 是缺氧誘導因子，在缺氧環境下表達上調，進而上調MMP?2、MMP?9 的表達，促進腫瘤血管生成；同時，HIF?1α 的異常表達調控免疫相關細胞向免疫抑制表型轉化，促進腫瘤的免疫逃逸。三物白散作用于該通路的靶點有19 個（P＜0.05），提示其可能通過該通路調控免疫細胞表型，發揮免疫調節作用。炎性微環境存在大量的炎性介質，可引起細胞基因突變，促進腫瘤發展與轉移。TNF 信號通路與細胞增殖、炎癥與免疫反應有關，激活后，可進一步激活NF?κB 信號通路和MAPK 信號通路，促進炎癥因子TNF、IL?6 等的釋放，炎癥因子的釋放又可促進炎癥通路的激活，形成惡性循環［35］。本研究表明三物白散富集在該通路的靶點有23 個（P＜0.05），說明其可能通過相關富集靶點調控TNF 通路以抑制炎癥因子釋放，從而抗腫瘤。代謝重塑在腫瘤發生中發揮重要作用，發生重塑的代謝物主要是糖、脂質、氨基酸等。脂肪細胞因子對代謝的影響主要是介導炎癥、細胞增殖和血管生成，其可直接進入血循環影響癌癥［36］。PPARs 為細胞內過氧化物酶體增殖物激活受體，在調節炎癥反應、糖、脂代謝中均發揮重要作用。其亞型PPARα 可綁定Glut1 基因啟動子區域直接抑制其轉錄，從而減少葡萄糖的攝取，最后，抑制mTOR 信號通路及腫瘤生長［37］。PPARγ 配體可抑制巨噬細胞炎癥反應，抑制活化T 細胞的增殖，調控細胞分化周期，從而發揮調控炎癥和免疫反應平衡、抑制腫瘤的作用［38］。PPARδ可通過降低氧化應激反應，增強生存信號（p?AKT）以延長癌細胞的生存率［39］。三物白散作用于胃癌的靶點富集在PPAR 通路上的主要有PPARδ、PPARγ 及相關配體，這提示三物白散可能通過調節該信號通路以調節炎癥、糖脂代謝，從而發揮治療胃癌的作用。

綜上所述，三物白散可能作用于缺氧、炎癥、代謝相關因子、通路，調控缺氧狀態，抑制炎癥反應，調節代謝過程，改善腫瘤微環境，抑制細胞增殖與血管生成，促進細胞凋亡，從而發揮治療胃癌的作用，這為深入探討三物白散治療胃癌的作用機制提供了新的方向。