黑老虎葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

李亞軍 黃國保 全海燕 易鵲 譚明雄

摘 要：為探討超聲波輔助提取黑老虎葉總黃酮的最佳提取工藝條件及其抗氧化活性，該文以黑老虎葉為研究對象，采用超聲波提取法提取黑老虎葉總黃酮，通過單因素試驗研究提取時間、乙醇濃度、提取溫度、料液比對黑老虎葉總黃酮提取率的影響，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優化其提取工藝條件，測試了最優條件下提取的黑老虎葉總黃酮對DPPH自由基、·OH自由基及超氧陰離子的清除能力。結果表明：黑老虎葉總黃酮超聲輔助提取最佳提取條件為提取時間 35 min、乙醇濃度80%、提取溫度50 ℃、料液比1∶20 g·mL-1，最佳條件下提取率為4.83%?？寡趸钚詼y試結果顯示，黑老虎葉總黃酮表現出較好的清除DPPH自由基、·OH自由基及超氧陰離子能力，其抗氧化能力為清除DPPH自由基能力>清除超氧陰離子能力>清除·OH自由基能力。在濃度為0.8 mg·mL-1時，黑老虎葉總黃酮清除DPPH自由基、·OH自由基及超氧陰離子的能力相當于同濃度下Vc的97.6%、82.1%、

95.5%，黑老虎葉總黃酮是天然抗氧化劑的良好來源。上述結果為黑老虎葉活性成分的提取及開發利用提供了理論基礎。

關鍵詞：黑老虎葉，總黃酮，超聲波輔助提取，工藝優化，抗氧化活性

中圖分類號：Q946

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）09-1381-08

Abstract：In order to study the optimum extraction conditions and antioxidant activity of total flavonoids from Kadsura coccinea leaves assisted by ultrasound extraction method，the ultrasonic-assisted extraction method of total flavonoids from K. coccinea leaves was studied，the influence factors of extraction time，ethanol concentration，extraction temperature and solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from K. coccinea leaves were studied by single factor expe-riment， and orthogonal experiment was used to optimize the extraction process. The scavenging effects of total flavonoids extracted from K. coccinea leaves on DPPH，·OH and superoxide anion were tested under the optimum conditions. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows：extraction time 35 min，ethanol concentration 80%，extraction temperature 50 ℃ and solid-liquid ratio 1∶20 g·mL-1 ，the maximum yield was 4.83%. The antioxidant activity test showed that total flavonoids of K. coccinea leaves had strong scavenging abilities on DPPH free radicals，·OH free radicals and superoxide anions. The order of antioxidant activities of total flavonoids from K. coccinea leaves was as follows：DPPH free radicals scavenging ability > superoxide anions scavenging ability > ·OH scavenging ability. At the concentration of 0.8 mg·mL-1，the scavenging abilities of total flavonoids from K. coccinea leaves on DPPH， ·OH free radicals and superoxide anions were equivalent to 97.6%，82.1% and 95.5% of Vc at the same concentration，respectively. Total flavonoids of K. coccinea leaves were good sources of natural antioxidants. This study provides theoretical information for the extraction and utilization of active ingredients from K. coccinea leaves.

Key words：Kadsura coccinea leaves，total flavonoids，ultrasonic-assisted extraction，technology optimization，antioxidant activity

黑老虎（Kadsura coccinea）為五味子科南五味子屬常綠木質藤本植物，別名過山龍、冷飯團、鉆地風等，主要分布于我國江西、湖南、福建、廣西等地（延在昊等，2013）。黑老虎是一種藥食兩用的中藥材，根莖葉果實均可藥用，其根莖為主要藥用部位，具有行氣活血，通經止痛等作用（陸俊等，2018）?，F代藥理活性研究表明黑老虎根莖及果實中的多種活性成分具有保肝（Song et al.，2010）、抗炎抑菌（Li et al.，2012）、抗腫瘤（Zhao et al.，2014）、抗HIV（楊毅等，2003）、抗氧化（延在昊等，2013;謝瑋等，2016）、抗凝血（Su et al.，2019）、調節血脂（李志春等，2011）等作用。黑老虎葉四季常青，其葉可用于治療濕疹（Rehman et al.，2019）。目前，關于黑老虎有效成分的提取及藥理活性研究主要集中在其根莖及果實，對其葉的開發利用報道較少。

抗氧化劑包括兩大類：化學合成抗氧化劑與天然抗氧化劑。由于天然抗氧化劑具有安全、無毒的特點，從植物中尋找天然抗氧化劑已成為國內外研究的熱點。黃酮類化合物廣泛存在于植物的葉與果實中，有研究報道從植物中提取的黃酮類化合物具有較強的抗氧化作用（Chanput et al.，2016），如羅布麻葉總黃酮（潘思源等，2019）、藿香葉黃酮（艾薇等，2018）、紅姑娘莖葉總黃酮（姜秀娟等，2018）等多種植物葉總黃酮具有顯著的抗氧化活性，可用于天然抗氧化劑的開發。目前，關于黑老虎抗氧化活性的報道主要有黑老虎莖中的揮發油成分（Rehman et al.，2019）、黑老虎果中花色苷（郝杰，2014）及β-環糊精和它的衍生物2-羥丙基-β-環糊精包合黑老虎果實花色苷提取物（Su et al.，2018）、黑老虎根中的酚酸類成分（延在昊等，2013）。黑老虎葉中黃酮成分作為天然抗氧化劑的研究未見報道。因此，從藥用植物黑老虎葉中高效提取總黃酮并研究其抗氧化性非常重要。黃酮類化合物的提取有臨界流體萃?。⊿FE）、溶劑提取法、超聲輔助提?。║AE）、微波輔助提?。∕AE）、脈沖電場（PEF）輔助提取、酶輔助提?。‥AE）等，其中超聲輔助提取具有提取效率高、提取時間短、溶劑用量少、提取方法簡便等優點而被廣泛使用（萬新煥等，2019）。

本研究采用超聲輔助提取黑老虎葉總黃酮，并從提取時間、乙醇濃度、提取溫度、料液比四個因素優化黑老虎葉總黃酮提取工藝，進一步測定了最優提取條件下黑老虎葉總黃酮的抗氧化活性，為黑老虎葉總黃酮的提取提供技術指導，為其開發為天然抗氧化劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器、設備

1.1.1材料 黑老虎葉：5月份采摘于湖南環境生物職業技術學院林下種植基地內，經湖南環境生物職業技術學院醫藥技術學院楊軍衡副教授鑒定為五味子科（Schisandraceae）南五味子屬 （Kadsura Jussieu）植物黑老虎（Kadsura coccinea）。

1.1.2 試劑 蘆丁標準品（純度≥98 %）：北京普析科技有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、維生素C、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、鹽酸、雙氧水、水楊酸、95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鄰苯三酚、石油醚、氫氧化鈉等試劑都為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器和設備 UV-2600紫外可見分光光度計（上海百賀儀器科技有限公司）;KQ-5200E超聲波清洗儀（長沙天恒儀器有限公司）;XB-0.3 真空旋轉濃縮儀（上沈陽樂華生物制藥設備有限公司）;FA 124萬分之一電子分析天平（湖南軒彩科學儀器有限公司）;DHG-9000- 9030A電熱恒溫鼓風干燥箱（長沙天恒儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 黑老虎葉中總黃酮的提取 黑老虎葉采摘后洗凈，60 ℃下烘干至恒重，粉碎后過60目篩即得黑老虎葉粉末。精確稱取黑老虎葉粉末2.0 g，石油醚脫脂，濾渣在超聲功率為250 W，在一定提取溫度、提取時間、乙醇濃度和料液比條件下進行超聲輔助提取，提取液減壓濃縮，70%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得黑老虎葉總黃酮樣品溶液。

1.2.2 蘆丁標準曲線的制備 采用 NaNO2 -Al（NO3）3-NaOH 法（梁志遠等，2016）制備蘆丁標準曲線。準確稱取干燥好的蘆丁50 mg，用70%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中。準確量取蘆丁樣品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL容量瓶中，分別依次加入0.8 mL 5% NaNO2與10% Al（NO）3，每加入一次試劑室溫下反應5 min，然后再加入10 mL 1 mol·L-1 NaOH后用70%乙醇定容至刻度，室溫下反應15 min，在510 nm處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，蘆丁溶液濃度C（mg·mL-1）為橫坐標制作標準曲線：y=4.541 1x+0.002 6，R2 =0.999 3。

1.2.3 總黃酮含量的測定和計算 準確量取1.2.1中黑老虎葉總黃酮樣品溶液1 mL，按照1.2.2方法測定樣品溶液吸光度，將測定所得吸光度代入標準曲線計算出測試溶液總黃酮濃度C（mg·mL -1）。按照下式計算總黃酮提取率（%）：提取率=C100%。式中：V為提取液體積（mL）;N為稀釋倍數;m為黑老虎葉粉末重量（g）。

1.2.4 單因素試驗和正交優化試驗 按照1.2.1的方法，在其他因素一定的情況下，分別以不同提取時間（15、25、35、45、55 min）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 、1∶30 g·mL -1）進行單因素試驗。

根據單因素試驗結果，選擇提取時間（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）、料液比（D）為自變量，以黑老虎葉總黃酮提取率為評價指標，采用L9（34）正交試驗優化黑老虎葉總黃酮提取工藝參數，正交試驗因素水平如表1所示。

1.2.5 黑老虎葉總黃酮抗氧化試驗 在最優條件下提取得到的黑老虎葉總黃酮按照以下方法進行抗氧化活性試驗測試。

1.2.5.1 黑老虎葉總黃酮對DPPH清除能力的測試 參照龐玉新等（2015）的方法，將最優條件下提取的黑老虎葉總黃酮溶解于70%乙醇配制成不同濃度（0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL -1）的樣品溶液，分別取以上樣品溶液1.0 mL，加入2.5 mL一定濃度的DPPH溶液，反應半小時后測定其吸光度，相同條件下測定空白對照溶液吸光度，以Vc為對照品。

1.2.5.2 黑老虎葉總黃酮對·OH自由基清除能力的測試 參照姜秀娟等（2018）的水楊酸法，測試最優條件下提取的黑老虎葉總黃酮（溶于70%乙醇）在不同濃度下（0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL -1）對·OH自由基的清除能力，以Vc為對照品。

1.2.5.3 黑老虎葉總黃酮對超氧陰離子清除能力的測試 將最優條件下提取的黑老虎葉總黃酮溶解于70%的乙醇配制成不同濃度（0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL -1）樣品溶液，參照范艷麗等（2017）的鄰苯三酚氧化法，測定以上樣品溶液對超氧陰離子的清除能力，相同條件下測定空白對照溶液吸光度，以Vc為對照品。

1.3 數據處理分析

所有實驗都重復進行3次，所得數據都以平均值±標準誤差表示，采用 Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0、 Design Expert8.0.6 軟件進行數據處理、分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對黑老虎葉總黃酮提取率的影響 如圖1所示，在15～35 min，黑老虎葉總黃酮提取率隨著時間的延長而逐漸增加，35 min時達到最大值4.31%;隨著時間的延長，提取率有所下降。這可能是因為時間較短時，黑老虎葉總黃酮并沒有提取完全，所以時間增長提取率增大;然而加熱提取時間較長則可能會破壞黃酮的結構而導致黑老虎葉中總黃酮提取率下降（李欣燃等，2019）。因此，提取時間優化試驗范圍為25～45 min。

2.1.2 乙醇濃度對黑老虎葉總黃酮提取率的影響 如圖2所示，在乙醇濃度為40%～70%，黑老虎葉總黃酮提取率呈線性遞增，70% 時達到最大值4.62%，隨后提取率下降。根據“相似相溶”原理，黑老虎葉總黃酮的極性與70%乙醇極性相似，所以在乙醇濃度為70%時提取率最大;隨著乙醇濃度的增大，醇溶性雜質提取程度也會增大，由于雜質與黃酮存在競爭關系，從而導致黃酮提取率的降低（艾薇等，2018）。因此，乙醇濃度優化實驗范圍為60%～80%。

2.1.3 提取溫度對黑老虎葉總黃酮提取率的影響 如圖3所示，溫度低于60 ℃時，黑老虎葉總黃酮提取率隨著溫度的增加逐漸增大，60 ℃達到最大值4.53%，隨后提取率逐漸降低。這可能是由于溫度的升高分子間運動變得劇烈，增大了黃酮與乙醇的接觸機會，所以提取率增大;但溫度過高也會造成部分黃酮結構破壞，從而降低提取率（張軍武和趙琦，2012）。因此，提取溫度優化實驗范圍為50～70 ℃。

2.1.4 料液比對黑老虎葉總黃酮提取率的影響 如圖4所示，在物料一定時，總黃酮提取率隨著溶劑量的增加逐漸增大，1∶20 g·mL-1時達到最大值4.53%，而當料液比大于1∶20 g·mL-1后總黃酮提取率增大不明顯。這可能是由于在一定范圍內，溶劑量的增加導致物料與溶劑的接觸面積增大，故黃酮提取率增大;而當料液比達到一定值后，物料與溶劑量的比例達到一個飽和狀態，此時再增加溶劑的量對提取率影響不大，反而會造成溶劑的浪費。因此，乙醇濃度優化實驗范圍為1∶15 ～ 1∶25（g·mL-1）。

2.2 正交優化試驗

由表2可知，各因素影響黑老虎葉總黃酮提取率的順序如下：乙醇濃度（B）> 提取時間（A）> 提取溫度（C）>料液比（D）。最佳提取條件為A2B3C1D2，即提取時間為35 min、乙醇濃度80%、提取溫度50 ℃、料液比1∶20 g·mL-1。在此條件下黑老虎葉總黃酮提取率為4.83%。

2.3 黑老虎葉總黃酮抗氧化試驗

2.3.1黑老虎葉總黃酮清除DPPH自由基能力 由圖5可知，在濃度為0～0.20 mg·mL-1時，隨著黑老虎葉總黃酮濃度的增加，其對DPPH自由基清除能力逐漸增大。在濃度為0.8 mg·mL-1時，黑老虎葉總黃酮對DPPH自由基清除率為94.3%，相當于該濃度下Vc對DPPH自由基清除率的97.6%，表明黑老虎葉總黃酮能夠很好地清除DPPH自由基。

黑老虎葉總黃酮清除DPPH自由基的IC50為0.067 mg·mL-1，段宙位等（2015）研究了沉香葉黃酮類化合物清除DPPH自由基的IC50為1.14 mg·mL-1，表明黑老虎葉總黃酮對DPPH自由基具有較好的清除能力。

2.3.2 黑老虎葉總黃酮清除·OH自由基能力 由圖6可知，在濃度為0～0.20 mg·mL-1時，黑老虎葉總黃酮對·OH自由基清除能力隨著濃度的增加逐漸增大。在濃度為0.8 mg·mL-1時，雖然黑老虎葉總黃酮對·OH自由基的清除能力低于同濃度下的Vc，但其對·OH自由基清除率達到了82.1%，相當于該濃度下Vc清除·OH自由基能力的87.2%，表明黑老虎葉總黃酮對·OH自由基有較好的清除能力。

黑老虎葉總黃酮清除·OH自由基的IC50為0.125 mg·mL-1。艾薇等（2018）研究了藿香葉總黃酮清除·OH自由基的IC50為281.89 mg·mL-1，表明黑老虎葉總黃酮能較好地清除·OH自由基。

2.3.3 黑老虎葉總黃酮清除超氧陰離子能力 由圖7可知，黑老虎葉總黃酮對超氧陰離子清除能力隨著濃度的增加逐漸增大，這說明二者之間存在明顯的量效關系。在濃度為0.8 mg·mL-1時，黑老虎葉總黃酮對超氧陰離子清除率為93.7%，相當于該濃度下Vc清除超氧陰離子能力的95.5%，表明黑老虎葉總黃酮能夠較好地清除超氧陰離子。

黑老虎葉總黃酮清除超氧陰離子的IC50為0.091 mg·mL-1，張黎明等（2014）研究了瑪咖葉總黃酮清除超氧陰離子的IC50為0.425 mg·mL-1，表明黑老虎葉總黃酮對超氧陰離子具有較好的清除能力。

3 討論與結論

黃酮存在于植物的葉、花及果實中，目前關于黃酮的提取方法有超聲輔助提取法、溶劑提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等（萬新煥等，2019）。超聲輔助提取法通過提供高頻率振動，結合空化、機械等多種效應使植物細胞壁破裂;溶劑通過擴散、滲透等效應，根據“相似相溶”原理將細胞內有效成分溶解出來。相比傳統的溶劑提取法，高頻率的超聲波產生的能量可以縮短提取時間，減少溶劑用量，降低提取溫度，提高提取效率。相比超臨界流體萃取法而言，其對提取設備要求較簡單。超聲提取法由于其綠色環保、提取效率高、提取條件溫和受到了廣大研究者的喜愛（Garcia-Castello et al.，2015）。本研究以湖南珍稀資源黑老虎葉為研究對象，采用超聲輔助提取其總黃酮，通過單因素及正交實驗得到最佳提取工藝條件為時間35 min、乙醇濃度80%、提取溫度50 ℃、料液比1∶20 g·mL-1，最優條件下提取率為4.83%，提取效率較高。

科學研究發現，當人體新陳代謝過程中產生的自由基得不到及時清除，過多的自由基將通過氧化作用對人體造成各種損害，如衰老、心血管疾病及炎癥等（周益帆等，2019）。從天然植物中尋找副作用低、效果好的抗氧化劑是現在的研究熱點。黃酮由于其獨特的結構特點，常作為天然抗氧化劑來源。黃酮發揮其抗氧化作用機制主要通過三個方面：（1）作用于產生自由基的酶或過渡金屬離子來間接清除自由基;（2）直接清除自由基（如DPPH自由基、·OH自由基及超氧陰離子等）;（3）通過激活機體抗氧化體系（如酶體系、抗氧化因子等）來實現清除自由基（魯曉翔，2012）。本研究通過測試黑老虎葉總黃酮清除DPPH自由基、·OH自由基及超氧陰離子的能力來評估其抗氧化強弱。在濃度為0.8 mg·mL -1時，黑老虎葉總黃酮清除DPPH自由基、·OH自由基及超氧陰離子的能力相當于同濃度下Vc的97.6%、82.1%、95.5%，這表明黑老虎葉總黃酮具有較好的清除以上三種自由基的能力，可以作為天然抗氧化劑來源。這可能是由于黑老虎葉黃酮苯環上存在的羥基能夠和自由基發生氧化還原反應生成穩定的半醌式結構，從而阻礙了自由基鏈式反應的發生而發揮抗氧化作用（魯曉翔，2012）。

黑老虎為廣西、湖南等地常見的藥食兩用的珍貴植物，目前對黑老虎有效成分的研究主要集中在根莖及果實，對其葉的開發利用鮮有報道。本研究立足于湖南珍稀植物黑老虎葉，探討了高效提取其總黃酮的工藝條件，為其提取提供技術路線;測試了黑老虎葉總黃酮體外抗氧化活性，為其用于食品保健品及護膚品的開發提供理論基礎。此外，在后續研究中可進一步探討黑老虎葉總黃酮體內抗氧化活性、作為抗氧化劑用于保健品或藥物的劑型及其他生物學活性，如抗炎、抗腫瘤等。

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（責任編輯 周翠鳴）