一種快速脫鹽制備大腸桿菌電轉化感受態細胞的方法

蔡松 楊東成 唐梅

摘要：為了建立一種高效快捷的大腸桿菌（Escherichia coli）電轉化方案，采用類似密度梯度離心的方法，使用角轉子離心機達到快速除鹽的目的。研究發現，以20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液作為梯度介質，采用菌懸液與梯度介質比例為1∶5 （V/V）時形成的密度梯度可有效地進行離心除鹽，離心后的細胞以20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液重懸，隨后在電場強度為15 kV/cm的條件下進行電轉化能得到較高的轉化效率，而在室溫條件下進行電轉化試驗不能提高轉化效率。本研究僅通過2次離心，電轉化效率可達到4.2×109 CFU/μg DNA，大大簡化了試驗流程。

關鍵詞：電轉化;感受態細胞;脫鹽;大腸桿菌（Escherichia coli）

中圖分類號：Q812 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0170-05

Abstract： A similar density gradient centrifuge method was adopted to establish an efficient and fast protocol for Escherichia coli electrotransformation. Angle rotor centrifuge was used to achieve the goal of rapid desalination of cells using 20% glycerol （V/V） /1.5% mannitol （m/V） solution as gradient medium. The ratio of bacteria suspension to gradient medium was 1∶5 （V/V） to form a density gradient， which led to effectively centrifugal desalination. After centrifugation the cells were resuspended in a mixture of 20% glycerol ?（V/V）/1.5% mannitol （m/V）， sequentially electroporated at 15 kV/cm. This procedure was suitable for effective desalination. Electroporation at room temperature did not improve transformation efficiency. In this study， the electransformation efficiency can reach 4.2×109 CFU/μg DNA only by two centrifugation， which greatly simplifies the experimental procedure.

Key words： electrotransformation; competent cells; desalting; Escherichia coli

電轉化方法相比化學轉化方法，具有轉化效率極高的特點[1]，傳統的RED基因敲除技術[2]和最新的crispr/cas9-基因敲除/置換技術[3]高度依賴于電轉化方法。相比較而言，傳統化學轉化一般不能勝任基因敲除中轉化大量核酸片段的工作，雖然一些高效的化學轉化方法如Hananan[4]法以及Inoue[5]法理論轉化效率能達到1.0×108～1.0×109 CFU/μg DNA，也能滿足電轉化需要——構建高質量的基因文庫、抗體庫和突變庫等工作，但從很多研究來看，自制的化學感受態細胞轉化效率僅為1.0×107 CFU/μg DNA甚至更低[6]，很多時候只能購買價格昂貴的商業化感受態細胞來進行相關試驗，這無疑增加了科研成本。制備高效的電轉化細胞方法一直是研究關注的熱點，優化培養基、細胞培養時添加組分、尋找適宜菌齡的感受態細胞及細胞濃度等[7]，都可以進一步提高電轉化方法的實用性和高效性。

雖然電轉化具有轉化效率高的特點，但在制備感受態細胞時也面臨制備時間長、相關步驟繁瑣等問題。由于電轉化的試驗原理要求細胞懸浮液中導電離子盡可能少，且常規電轉化需要低溫離心多次去鹽[8]，因此增加了整個轉化過程的操作時間，反復離心和重懸細胞還會影響感受態細胞的轉化效率。有研究提出了類似密度梯度離心的方式[9]，以達到快速除鹽的目的，這種方法大大減少了離心次數，但需要使用具有水平轉子的離心機，且要求離心機轉速變化緩慢且平穩，這對普通科研實驗室的離心機設備提出了一定要求。

基于以上思路，本研究提出在具有角轉子的任意離心機上制備高感受態細胞的方法。不同于上述方法在離心管中菌液底部加入梯度介質，本研究提出先加入梯度介質形成密度梯度，再加入濃縮好的菌液。兩種方法都基于密度梯度離心，但后者能調整菌液與脫鹽介質體積以及菌液的添加方式，從而達到更好的離心去鹽效果。

此外，目前有不少研究認為，在室溫乃至更高溫度下進行電轉化細胞制備，轉化效率更高[10]，為了進一步簡化電轉化細胞制備，本研究也嘗試在室溫下進行電轉化細胞的制備，并評估了溫度對電轉化效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 本研究采用大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α以及質粒pUC19，均由實驗室-18 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 蔗糖（AR）、甘油（AR）、甘露醇（AR）室溫保存，氨芐青霉素（>95%）4 ℃保存，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基 LB固體培養基：1%（m/V）蛋白胨，0.5%（m/V）氯化鈉，0.5%（m/V）酵母粉，2%（m/V）葡萄糖，2%（m/V）瓊脂粉;抗性篩選培養基：LB固體培養基，氨芐青霉素50 mg/L;SOC培養基：2%（m/V）蛋白胨，0.5%（m/V）酵母粉，0.05%（m/V）氯化鈉，0.018 6%（m/V）氯化鉀，0.095%（m/V）氯化鎂，0.36%（m/V）葡萄糖。

1.1.4 主要儀器與設備 電擊杯和MicroPulser電穿孔儀（美國 Eppendorf公司），Centrifuge 5417R和Centrifuge 5804R離心機（美國 Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 電轉化感受態細胞的制備

1）從甘油管取大腸桿菌 DH5α于無抗性的新鮮LB瓊脂平板上劃線，37 ℃恒溫培養箱過夜培養。

2）從活化 LB 平板上挑取單菌落接種于50 mL SOC培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養至菌液OD600 nm為0.3～0.6作為種子液，按種子液1%的接種量接種于100 mL SOC培養基中，后置于37℃搖床，200 r/min，培養至菌液OD600 nm為0.3～0.6。

3）將培養物轉移至2支50 mL的無菌離心管冰浴15 min，后4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄除上清液，各加入1 mL預冷的20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液重懸細胞，將其中1支離心管重懸后的菌液轉移至另1支共2 mL，后置于冰水浴中。

4）向15 mL無菌離心管中加入10 mL預冷的無菌梯度介質含20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V），后使用1 mL移液槍沿著離心管內壁緩慢傾斜注入2 mL菌懸液，使其水平鋪展至甘油/甘露醇層表面。

5）隨后4 ℃、4 000 r/min離心15 min，先用移液槍將上層水層去除，再將下層甘油/甘露醇層去除，盡量去除離心管內的殘余液體。

6）向離心管內部加入100 μL預冷的20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液重懸細胞，取80 μL重懸液于1.5 mL EP管用于后續電轉化試驗。

1.2.2 電轉化 取感受態細胞80 μL和1 ng/μL的pUC19質粒于冰水浴中解凍，迅速向感受態細胞中加入5 μL pUC19質粒，用移液槍輕柔地混勻，再置于冰水浴中2 min，然后立即將細胞轉移至已預冷的電擊杯中，按照預設電擊條件進行電擊，電擊結束后立即加入915 μL已在37 ℃搖床預熱的SOC培養基中，于37 ℃、200 r/min培養1 h，后取100 μL菌液稀釋103～104倍后，再取100 μL稀釋后的菌液涂布于Amp抗性平板，放于37 ℃的恒溫培養箱培養14～16 h，待平板長出菌落后，開始計算抗性平板上的菌落數，并計算電轉化效率，具體公式如下：

[電轉化效率（CFU/μg DNA）=][菌落數×稀釋倍數DNA量（μg）] ? ?（1）

2 結果與分析

2.1 密度梯度離心技術的探索

2.1.1 離心方式的改進 有研究提出了類似密度梯度離心的方法[9]，可以達到快速除鹽的目的，大大減少了離心次數，其操作方式如圖1a所示，主要利用了密度梯度離心的原理，在一個固定的離心力和液體黏度條件下，顆粒沉降速率主要與其自身密度ρ與溶液介質密度L之間的差值成比例，見公式（2）。

一般水作為介質時，密度ρ為1.00 g/mL（室溫），用20%的甘油調整溶液介質密度ρ約為1.05 g/mL[11]，而鹽水的密度ρ約為1.01 g/mL[12]，因此，以20%甘油作為離心時的介質，大腸桿菌沉降，而鹽水溶液難以沉降，從而達到細胞和鹽分的分離。該方法步驟簡單，但以角轉子的離心機離心時，往往難獲得高效率的電轉化感受態細胞。

[v=d2（ρ-L）18μ×g] ? （2）

式中，v為細胞的沉降速度（m/s），d為顆粒直徑（m），[ρ]為顆粒密度（kg/m3），L為介質密度（kg/m3），μ為介質黏度（mPa·s），g為離心力（kg·m/s2）。

鑒于此，本研究對該方法進行了改進，如圖1b所示，借鑒傳統的用于細胞或細胞器分離的密度梯度離心方法[13]，將菌液濃縮后鋪展至梯度介質層進行梯度離心，采用橫截面積更小的15 mL離心管，以此提高梯度層的穩定性，改變大腸桿菌的脫鹽效率。

2.1.2 密度梯度介質的選擇 密度梯度離心常用的梯度介質為甘露醇、山梨醇、甘油、蔗糖、多聚糖和中性硅膠油等[14]，對于活性細胞的分離常選用蔗糖、甘油或中性硅膠油等為梯度介質，但同樣密度的甘油相比于蔗糖來說，其滲透壓更小、黏度更大，在離心分離過程中有利于維持細胞內外滲透壓，同時黏度的增加有利于維持樣品層與梯度層的穩定。其次，甘油相比于中性硅膠油價格也更便宜。因此，以甘油作為梯度介質較為經濟合理。

2.1.3 梯度介質濃度對密度梯度離心的影響 分別以不同濃度的甘油水溶液作為梯度介質，經4 ℃、4 000 r/min離心15 min后，如表1所示，當甘油水溶液比重達到20%（V/V）及以上時，即ρ≥1.05 g/mL，水層與甘油層實現明顯的分層，即以20%甘油水溶液作為密度梯度介質。為了探究20%甘油水溶液中加入不同質量分數的甘露醇是否會影響離心前后的分層情況，經4 ℃、4 000 r/min離心15 min后，均明顯分層。因此，20%甘油水溶液加入不同質量分數的甘露醇對于離心前后的分層情況沒有影響（表1）。

2.2 不同濃度的甘油/甘露醇溶液對電轉化效率的影響

電擊結束后，往復蘇培養基中添加一定濃度的滲透溶液[15]能夠有效地提高電轉化效率;也有研究認為，使用一定濃度的滲透溶液重懸細胞再進行電轉化，對于效率的提高也有幫助[16]。為了進一步探究感受態細胞中滲透溶液對其電轉化效率的影響，經密度梯度離心后（圖1b），分別以預冷去離子水（即甘油與甘露醇濃度均為0）、20%甘油水溶液以及20%甘油水溶液加入不同質量分數的甘露醇（m/V）重懸細胞，輔助維持細胞在離心過程中的滲透壓平衡[11]。經3次重復試驗，由表2可知，以去離子水重懸細胞進行電轉化試驗，電轉化效率為1.3×109 CFU/μg DNA;以20%甘油（V/V）水溶液重懸細胞，電轉化效率最高達到2.1×109 CFU/μg DNA;而當往20%甘油（V/V）水溶液加入不同質量分數的甘露醇重懸細胞，相較于僅使用甘油水溶液重懸細胞，其效率均有一定程度提高，且以20%甘油（V/V）/1.5%甘露醇（m/V）溶液重懸細胞時，電轉化效率最高達到3.3×109 CFU/μg DNA。

在電擊過程中瞬時的高壓使細胞形成空隙，細胞在一定時間內慢慢吸收外界物質如核酸片段，但由于胞內與胞外滲透壓的差異，使得細胞內液大量外流，導致細胞大量死亡，同時也不利于外源DNA進入細胞。而通過使用20%甘油/1.5%甘露醇溶液重懸細胞，使得電轉的感受態細胞處于一定濃度的滲透溶液中，能夠維持細胞內外的滲透壓平衡，從而有效防止細胞內容物外流，提高了細胞的存活率，使最終的電轉化效率進一步得到提高。

2.3 梯度介質體積對電轉化效率的影響

密度梯度離心法的優點在于僅離心1次就獲得較純的樣品顆粒，減少離心步驟。但使用密度梯度離心法分離樣品時，樣品的添加體積是試驗成敗的關鍵因素之一[17]。為此，將菌懸液體積固定為2 mL，通過改變梯度介質的體積，以探索梯度介質體積對分離效果的影響，進而找到最適合的菌懸液/梯度介質體積比。經過3次重復試驗，由圖2可知，隨著梯度介質體積的提高，電轉化效率不斷提高，當兩者體積比為1∶5時，電轉化效率達到3.6×109 CFU/μg DNA，而后再增加梯度介質體積，電轉化效率趨于平緩。

電轉化效率的高低關鍵在于是否制備出低鹽濃度的感受態細胞和DNA片段，一般所制備的DNA片段經純化后鹽濃度都很低，所以電轉化效率主要取決于感受態細胞中鹽離子的含量。感受態細胞中鹽成分去除不凈，在電擊時瞬時的高壓會產生電弧導致細胞大量死亡[12]。通過減少菌液的體積增加梯度介質體積，梯度離心結束后實現了細胞與鹽分的有效分離，進而降低了感受態細胞中鹽離子的含量，從而減弱鹽離子對電轉化試驗的干擾。

2.4 電場強度對電轉化效率的影響

電場強度一直被認為是影響電轉化效率的重要因素[18]，同時，重懸液由去離子水轉變成20%甘油/1.5%甘露醇溶液，重懸液的改變是否也會影響電場強度對電轉化效率的影響，也需要進一步研究。為了探索電場強度大小以及重懸液的改變對電轉化效率的影響，分別采用不同重懸液重懸細胞在不同的電場強度下進行電擊試驗。經過3次重復試驗，結果表明，隨著電場強度的提高，電轉化效率隨之提高，當以去離子水重懸細胞，電場強度在13 kV/cm時，電轉化效率最高，達2.3×109 CFU/μg DNA，而當以20%甘油/1.5%甘露醇溶液重懸細胞，電場強度在15 kV/cm時，電轉化效率最高，達4.2×109CFU/μg DNA，隨后電轉化效率急劇降低（圖3）。

在進行電轉化試驗時，經高電場強度電擊后本身大量的細胞會死亡，只有少部分細胞存活下來，而攜帶了外源核酸片段的細胞存活下來的數量更少，在尋找到最適宜的電場強度后，再進一步增加電場強度反而會導致細胞大量死亡，電轉化效率急劇降低。同時，電擊緩沖液由20%甘油/1.5%甘露醇溶液代替去離子水時，在不同電場強度條件下的電轉化效率均有一定程度的提高，使得最適宜的電場強度由13 kV/cm變為15 kV/cm。

2.5 溫度對電轉化效率的影響

在制備電轉化細胞及電轉化試驗過程中通常溫度要保持在0～4 ℃[12]，也有不少研究認為室溫甚至更高溫度進行電轉化試驗相比于低溫其效率反而更高[19]。因此，為了進一步探究溫度對電轉化效率的影響，探索出更加簡便的電轉化試驗方案，本研究進行了3次重復試驗。由表3可知，在不同溫度梯度下進行電轉化感受態細胞的制備以及電擊試驗，隨著溫度的提高，電轉化效率急劇降低，當溫度為37 ℃時，其電轉化效率僅為7.3×107 CFU/μg DNA，而當溫度保持在0～4 ℃時，其電轉化效率可達 ? ?3.9×109 CFU/μg DNA，即0～4 ℃時的電轉化效率比37 ℃時提高了約52倍。

電轉化效率的提高意味著外源DNA進入更多的細胞，同時在電擊結束后有更多的細胞存活下來。在制備電轉化細胞時，需要使用預冷的去離子水洗滌細胞以去除培養基和導電溶質，所有的設備都需要提前預冷，而且整個操作過程需要保持低溫環境，具體的機理目前尚不清楚，可能的原因是保持低溫環境影響細胞膜的結構，使細胞壁與細胞膜的脆性增加，瞬時的高電壓更容易在細胞表面形成局部的瞬態孔隙[7]，使得外源DNA更容易滲透到細胞內部。但也有一些菌株在進行電轉化試驗時需要保持室溫甚至更高溫度，其觀點為細胞經多次低溫洗滌離心后，細胞結構會受到一定破壞[12]，不利于細胞的存活，經低溫制備出的感受態細胞更容易收縮，從而降低了細胞膜的流動性與通透性，瞬時的高電壓在細胞表面形成局部的瞬態孔隙減少，外源DNA反而不容易滲透到細胞內部，而溫度的提高能夠增加細胞膜的流動性，外源DNA更容易進入細胞。但通過對大腸桿菌DH5α進行多次反復的試驗驗證，發現隨著電轉化試驗過程中的溫度提高，電轉化效率反而急劇降低。也有許多類似研究認為以一般的大腸桿菌菌株進行電轉化試驗，整個試驗操作最好保持低溫操作才能保證較高的電轉化效率[12，20]。

3 小結

本研究分別對密度梯度離心技術及影響大腸桿菌電轉化效率的因素進行探索。首先，通過對梯度介質進行分析選擇，并對梯度介質濃度及菌懸液與梯度介質之間的體積比關系進行研究。利用15 mL離心管代替50 mL離心管，探索出一種類似于密度梯度離心法且適用于角轉子離心機的離心方法，使用角轉子離心機實現細胞與鹽分的有效分離，整個電轉化試驗僅需2步離心，省去了常規方法的多步洗滌離心除鹽，簡化了電轉化試驗步驟。其次，在確定好離心技術的同時進一步探究影響電轉化效率的因素——滲透溶液的濃度、梯度介質體積、電場強度以及電轉化試驗過程的溫度等。研究發現，菌懸液與脫鹽梯度介質比例為1∶5時，使用20%甘油/1.5%的甘露醇作為滲透溶液重懸細胞，在電場強度為 ?15 kV/cm下進行電擊，且制備電轉化感受態細胞及電轉化過程中溫度維持在0～4℃，最終所制備的感受態細胞電轉化效率達4.2×109 CFU/μg DNA，較傳統方法電轉化效率提高的同時也大大縮短了試驗時間，為以后的分子試驗打下了堅實的基礎。

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