EA-IL-15溶瘤腺病毒的構建及其對膠質瘤細胞特異性及有效性研究

季佳宇 王啟儼 方 勝 田毅夫 劉福生 米蕊芳

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性顱內腫瘤之一，其中約50%為惡性程度極高的膠質母細胞瘤。由于其具有廣泛浸潤性、血-腦脊液屏障的保護及局部和系統性的免疫抑制，在經過手術、放療和化療等綜合治療后其中位生存期僅為15個月[1，2]。溶瘤病毒療法(oncolytic virus therapy)是一種很有前途的癌癥基因治療療法，溶瘤病毒可以在惡性細胞中選擇性復制，導致癌細胞裂解，同時釋放腫瘤相關抗原(TAAs)、病原相關分子模式(PAMPS)和危險相關分子模式(DAMPS)刺激腫瘤細胞的適應性免疫反應[3,4]。

溶瘤腺病毒是最常見的溶瘤病毒之一，通過對相關基因的修飾或改造，溶瘤腺病毒可以在腫瘤細胞中進行特異性復制和裂解，引起炎性反應促進免疫應答[5]。在已經進行的臨床試驗中，溶瘤腺病毒顯示出令人滿意的安全性[6]。腺病毒具有高基因轉導效率和遺傳穩定性，其結構和基因功能已經有了比較完善的描述，對其進行修飾改造相對簡單易行[7，8]。然而，由于實體腫瘤的結構復雜及腫瘤微環境的存在，溶瘤病毒難以完全發揮作用。

人內皮抑素(endostatin, Endo)和血管生成抑素(angiostatin, Angio)作為一種融合的結構調節分子Endo-Angio能夠有效抑制血管內皮細胞增生。Endo-Angio 融合蛋白能夠抑制膠質瘤等腫瘤中新生血管的生長，破壞腫瘤微環境，且能夠抑制腫瘤細胞的增殖并極少產生耐藥性[9]。有研究顯示溶瘤病毒中插入人內皮抑素和血管生成抑素融合基因可以表達Endo-Angio 融合蛋白，能夠顯著抑制人腦微血管內皮細胞(HBMEC)的增殖[10]。

人白介素15(IL-15)是一種免疫調節分子，在淋巴細胞介導的腫瘤免疫應答過程中，IL-15可以促進T細胞增殖分化、B細胞相關抗體的分泌。有研究顯示，在溶瘤性水皰性口炎病毒(VSV)中插入高分泌型hIL-15感染腫瘤細胞，被感染的CT-26腫瘤細胞局部表達IL-15 明顯增強，導致T細胞的免疫反應增強[11]。本研究通過構建攜帶Endo-Angio、IL-15雙基因的溶瘤腺病毒，研究其在體外對膠質瘤細胞是否具有明顯的殺傷作用和特異性。

材料與方法

1.材料：GL261細胞和永生化的小膠質細胞系BV2購自中國醫學科學院。人神經膠質瘤細胞系U251從北京細胞庫獲得。DMEM培養基、PBS磷酸鹽緩沖溶液、胰蛋白酶和雙抗(100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)購自美國Gibco公司, 胎牛血清購自杭州四季青公司,CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。溶瘤病毒載體由筆者實驗室保存。

2.溶瘤腺病毒載體及插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒的構建：(1)溶瘤腺病毒載體(oAD)：去除腺病毒穿梭載體pXC1，在E1A區域添加survivin啟動子，刪除E1B區域的19kDa區域。(2)插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)：PCR的方法將EA-IL-15雙基因插入腺病毒穿梭載體pXC1，Endo-Angio基因和IL-15基因中間通過核糖體進入位點(IRES)連接，將穿梭質粒pXC1-EA-IL-15及輔助質粒pBHG loxΔE1, 3 Cre質粒共轉染HEK393細胞，得到溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。

3.細胞培養：GL261小鼠膠質瘤細胞和BV2小膠質細胞在常氧條件下用含有10%胎牛血清的DMEM、1%雙抗的培養基置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。細胞用含有0.05%的胰蛋白酶液進行消化和傳代。

4.細胞加藥實驗：取對數期細胞接種于96孔板中，培養24h，按照不同MOI值加入病毒感染，培養72h后觀察細胞狀態并定量分析細胞的相對活性。

5.CCK-8細胞毒性實驗：病毒感染72h，取出96孔板，每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃培養箱內孵育2h，酶標儀測定450nm處的吸光度。

結 果

1.構建溶瘤腺病毒載體(oAD)：去除腺病毒穿梭載體pXC1，在E1A區域添加survivin啟動子，使其對腫瘤細胞具有特異性感染；刪除E1B區域的19kDa區域，使得病毒獲得誘導腫瘤細胞凋亡的能力，并增加腺病毒的傳播能力，構建成溶瘤腺病毒載體(oAD)。體外病毒包裝得到空載溶瘤腺病毒oAD。

圖1 倒置顯微鏡下觀察空載溶瘤腺病毒(oAD)對膠質瘤細胞GL261形態的影響(×100)A.對照組；B.MOI=10 oAD處理組；C.MOI=100 oAD處理組

2.溶瘤腺病毒oAD對膠質瘤細胞的體外殺傷作用及特異性研究：溶瘤腺病毒oAD感染膠質瘤細胞GL261，72h后倒置顯微鏡下觀察，可見對照組細胞貼壁生長，排列規則，細胞密度大。實驗組中隨著MOI值的增高，細胞密度減少，細胞形態皺縮，詳見圖1。說明oAD對GL261細胞有一定的殺傷作用。將oAD同時作用于GL261細胞及小膠質細胞BV2(非腫瘤細胞)。感染72h后測定細胞相對活性，可以看到與對照組(PBS)比較，oAD對GL261具有明顯的殺傷作用(P<0.05)，并且在不同MOI值病毒的作用下，oAD對GL261的殺傷作用明顯高于對BV2，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 空載溶瘤腺病毒(oAD)特異性及有效性分析與對照組比較，*P<0.05；GL261與BV2比較，#P<0.05

3.構建插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)：為了增強溶瘤病毒對膠質瘤細胞的殺傷作用，筆者將Endo-Angio及IL-15基因定向克隆構建到溶瘤腺病毒oAD的腺病毒穿梭載體pXC1中，構建成EA-IL-15雙基因腺病毒載體pXC1-EA-IL-15。PCR的方法檢測所插入的基因，可見挑取的8個克隆株中有7個攜帶有EA-IL-15基因，詳見圖3。Endo-Angio基因和IL-15基因中間通過核糖體進入位點(IRES)連接，可同時表達，詳見圖4。筆者進一步將穿梭質粒pXC1- EA-IL-15及輔助質粒pBHG loxΔE1, 3Cre質粒共轉染HEK393細胞，得到溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。

圖3 插入EA-IL-15雙基因轉化子PCR鑒定分析1.空白對照組；2.陰性對照；3.陽性對照；4.250bp DNA Ladder(自上至下：5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp)；5～12.1～8號克隆轉化子

圖4 插入EA-IL-15雙基因的腺病毒穿梭載體pXC1結構

4.插入EA-IL-15雙基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15)對膠質瘤細胞的體外殺傷作用及特異性研究：統一兩病毒效價，將oAD-EA-IL-15及oAD溶瘤病毒分別感染GL261細胞，感染72h后測定細胞的相對活性，繪制劑量反應曲線?？梢婋S著溶瘤病毒濃度的增加，GL261細胞相對活性不斷下降。說明兩種溶瘤病毒對GL261細胞均有殺傷作用(P<0.01)，其中oAD-EA-IL-15對GL261細胞的殺傷作用明顯優于oAD(P<0.01)，詳見圖5。oAD-EA-IL-15對GL261細胞的半抑制濃度(IC50)值為0.58×107±1.30×105PFU/ml，低于oAD的IC50值1.13×107±1.98×105PFU/ml(P<0.01)，說明oAD-EA-IL-15對腫瘤細胞的殺傷作用強于oAD。

圖5 雙基因溶瘤腺病毒對小鼠膠質瘤GL261細胞作用分析與對照組比較，*P<0.01；#P<0.01

將oAD-EA-IL-15及oAD溶瘤病毒分別感染小膠質細胞(非腫瘤細胞)BV2。72h后在不同劑量下測定細胞的相對活性，詳見圖6?？梢钥吹給AD-EA-IL-15(P<0.05)對其活性的影響低于oAD(P<0.01)。在病毒效價同為108PFU/ml時，oAD-EA-IL-15感染下的BV2細胞相對活性高于 oAD (P<0.01)，說明oAD-EA-IL-15病毒的特異性優于oAD病毒。

圖6 雙基因溶瘤腺病毒特異性分析oAD及oAD-EA-IL-15病毒對BV2細胞的作用。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；#P<0.01

討 論

筆者在構建溶瘤腺病毒載體的時候選擇在E1A區添加特異性啟動子，特異性的腫瘤組織啟動子可以控制病毒增殖必需基因的表達，從而獲得病毒對腫瘤細胞的選擇性復制[12]。腫瘤特異性啟動子包括survivin啟動子、環氧化酶(COX-2) 啟動子、hTERT啟動子等。筆者選用的survivin啟動子在80%的膠質母細胞瘤腫瘤細胞中有豐富的表達，且其陽性腫瘤樣本的比例與膠質瘤的組織學分級存在明顯的相關性[13]。此外，筆者還刪除了E1B-19k區域，該區域所編碼產物功能類似于抗凋亡因子Bcl-2可以抑制Bax和TNF發揮抗凋亡作用，19k的缺失能夠協同溶瘤腺病毒在腫瘤細胞中特異性復制，增強病毒傳播能力[14]。在溶瘤腺病毒載體的基礎上筆者補充了結構調節基因Endo-Angio和免疫調節基因IL-15，希望病毒本身的溶瘤作用和外源基因的治療作用協同，增強病毒的擴散及對腫瘤的殺傷能力。

在體外實驗中可見，oAD-EA-IL-15和oAD對于腫瘤細胞均具有特異性的殺傷效果。對于腫瘤細胞，oAD-EA-IL-15的殺傷效果更好，對于非腫瘤細胞，oAD-EA-IL-15有更好的特異性，在溶瘤病毒的體內治療過程中，更好的特異性就意味著更好的安全性，加強患者的預后。

在面對體內的實體腫瘤中，腫瘤中存在不支持溶瘤腺病毒的復制的缺氧區域、相關成纖維細胞的積累、致密的細胞外基質和新生血管的形成都可以阻礙溶瘤腺病毒的傳播[8]。對此，通過構建攜帶Endo-Angio基因的溶瘤腺病毒，來達到抑制新生血管形成的作用，一方面在結構上減少實體腫瘤的復雜程度；另一方面減少腫瘤組織的血供，導致未感染的腫瘤細胞凋亡(旁觀者殺傷效應)，從而抑制腫瘤的生長[15]。腫瘤周圍還有腫瘤微環境，其中往往含有對溶瘤病毒有殺傷作用的自然殺傷(natural killer，NK)細胞，阻礙溶瘤病毒擴散的腫瘤基質等非腫瘤細胞、可以抵消溶瘤腺病毒免疫刺激優勢的Tregs、MDSCs等抑制性免疫細胞[16]。IL-15是NK細胞、自然殺傷類細胞以及CD44高表達CD8+T 細胞激活的必需因子，通過活化NK細胞可以增強抗腫瘤活性，且不會增加Tregs細胞的數量和活性[17，18]。IL-15還可以通過調節腫瘤微環境的組織間隙來促進溶瘤病毒的擴散，并且可以增加血管抑制性藥物的抗血管作用[19]。

綜上所述，本研究成功構建了溶瘤腺病毒載體(oAD)及oAD-EA-IL-15溶瘤病毒，并且體外實驗的結果表明，oAD-EA-IL-15溶瘤病毒對膠質瘤細胞GL261有明顯的殺傷作用，同時具有一定的特異性。本研究為oAD-EA-IL-15溶瘤病毒對膠質瘤及其他實體腫瘤的治療研究提供了良好的實驗依據。