組織透明化技術在非人靈長類神經退行性疾病研究中的應用進展

莊旭東 王心睿

神經退行性疾病，是由于大腦和脊髓的神經元或其髓鞘缺失，隨著時間的推移而惡化，導致運動（共濟失調）或精神（癡呆）功能問題，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD）、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、多發性硬化（multiple sclerosis，MS）和肌萎縮性脊髓側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等疾病，大部分不可治愈，造成了巨大的社會負擔[1-2]。

一直以來，小鼠是研究神經退行性疾病的常用模型，因為不能完全模擬人類神經退行性疾病的真實情況或在神經退行性病變的治療中發揮作用，所以不能廣泛用于神經退行性疾病研究[3]。非人靈長類和人同屬哺乳綱的靈長目，不論從基因組到神經解剖學，還是從免疫系統到行為學等方面，都與人類高度相似，是研究人類神經退行性疾病發病機制和治療方法的關鍵動物模型[4-6]。

眾所周知，自然界中斑馬魚的胚胎是透明的，有利于科學研究[7-8]。絕大多數生物由于內、外源性色素的存在、組織成分不同及其不均勻分布引起折射率的差異，生物組織高度不透明。有研究發現，嚙齒類動物研究中開發的組織透明化技術，適用于非人類靈長類動物[9-10]。非人靈長類動物經組織透明化技術處理，結合光學成像、熒光標記和數據整理與分析，理論上不僅能從立體上完整觀察非人靈長類神經退行性疾病動物模型，獲得高分辨率的器官、組織和細胞的結構信息；還能從全局研究完整非人靈長類神經退行性疾病動物模型的宏觀、介觀和微觀的生命現象和生物活動規律[11-12]。

一、組織透明化

組織透明化是通過不同化學試劑的組合使用結合浸泡、灌注、電泳等各種滲透方式，脫脂、脫色、脫鈣和擴張，改變折射系數（refractive index，RI），使得樣品的RI 與成像介質的RI趨近一致，減少光線折射，增加鏡下視野亮度，提高組織器官樣本透明度，最后實現3D 成像，立體觀察完整的生物體[13]。

目前組織透明化有3 種主要的方法：疏水法、親水法和水凝膠法。疏水法：主要包括溶劑清除器官的三維成像（threedimensional imaging of solvent cleared organs，3DISCO）、極限3DISCO、免疫標記的3DISCO（immunolabelling-enabled 3DISCO，iDISCO）和重鏈抗體的可變域3DISCO（variable domain of heavy-chain antibodies 3DISCO，vDISCO）；依賴于組織的完全脫水，使用有機溶劑進行脫水、脫脂和RI 匹配，可以快速有效透明組織且易于成像和保存，但可能收縮組織和漂白熒光蛋白。親水法：主要包括基于尿素的透明技術Sca/e、深部腦成像（see deep brain，SeeDB）、清晰且無阻礙的大腦或整體成像方法（clear,unobstructed brain or body imaging cocktails and computational analysis，CUBIC）、基于尿素和山梨醇的透明方案Sca/eS 和SeeDB2；基于水溶性溶液，比疏水法具有更高的生物安全性和相容性，過程包括脫色、脫脂和RI 匹配，但可能會擴張組織和需要更長的孵育時間。水凝膠法：主要包括清晰脂質交換丙烯酰胺雜交精細成像相容性組織水凝膠法（clear lipid-exchanged acrylamide hybridized rigid imagingcompatible tissuehydrogel，CLARITY）、原位灌注輔助藥物釋放透明法、X 倍擴展CUBIC、環氧化物交聯保護快速透明法、通用型組織染色成像法（CUBIC-HistoVIsion）和小膠束介導的人體器官透明化和標記[14-15]；使用單體和引發劑分子或聚環氧化物合成凝膠，進行脫脂和RI 匹配，既可多重標記，又保留著高分子蛋白、DNA 和RNA，還可使組織擴張數倍，但要求更長的孵育時間或是輔助處理設備。

這些組織透明化方法的選擇使用，要結合生物體組織器官的物理特性和實驗目的綜合考慮[16]。

二、組織透明化應用在非人靈長類神經退行性疾病

神經系統的復雜性和異質性導致研究進程緩慢，其中神經退行性疾病的發生發展涉及多種不同的細胞類型、錯綜復雜的神經回路和信號通路，組織透明化初步實現嚙齒類與非人靈長類動物的大腦3D 成像，與大體解剖和二維切片相比，更有利于研究神經退行性疾病的復雜性，有望為人類神經退行性疾病的機制研究和治療提供有力支持。

（一）AD

由于影響AD 發展的遺傳因素和環境因素非常復雜，AD的發病機制至今尚未得到充分的研究[17]。細胞外老年斑和細胞內神經纖維纏結是AD 的2 個病理特征[18]。細胞外老年斑主要存在于海馬體和新皮質，是Aβ 在神經元之間的異常積累和聚集而成，而神經纖維纏結與tau 蛋白的過磷酸化有關，從海馬狀突起擴散到大腦的不同區域中，破壞腦功能，引起患者的認知能力下降和記憶喪失[19-20]。

Ando 等[21]比較了CLARITY、Sca/e、SeeDB 和3DISCO 等組織透明方法，認為CLARITY 更適合于立體觀察AD 患者大腦皮層中Aβ 分布和聚集在神經元周圍的變性的tau 蛋白。Liebmann 等[22]借助iDISCO 立體觀察Aβ 在AD 模型小鼠大腦中的分布和磷酸化tau 的擴散方式，分析斑塊的形成和分布。Vints 等[23]通過CUBIC 結合熒光染料可使單個神經元3D成像，觀察AD 小鼠中Aβ 在神經元的不同階段所引起的形態變化?，F有的非人靈長類AD 模型建立方法很多，開發轉基因非人靈長類AD 模型或接種AD 患者的大腦勻漿，在藥物開發和免疫療法研究中能夠發揮更好的作用[24-26]。通過非人靈長類AD 動物模型結合組織透明化技術，有利于觀察AD神經元的退行性病變和Aβ、tau 蛋白等之間的演變過程，闡明AD 的潛在發病機制和藥物靶點。

（二）ALS

ALS 的病因、病理并不明確，主要累及大腦皮質運動區錐體細胞和腦神經核、脊髓前角細胞，主要病理改變是TDP-43蛋白在細胞質積累、運動神經元的減少和殘存神經元的變性，主要臨床表現為延髓支配四肢、軀干肌肉的無力和萎縮，最終惡化導致呼吸肌無力而窒息死亡[27-29]。

Hruska 等[30]將CUBIC 與受激發射減損顯微鏡相結合，3D成像觀察到小鼠脊髓樹突細胞與突觸前后的蛋白的量有關。Morawski 等[31]應用CLARITY 在人腦樣本，3D 成像觀察了大腦皮層介觀現象、皮質神經元形態和髓鞘纖維分布。Lee等[32]將ACT-PRESTO 應用在人類脊椎樣本，實現脊椎3D 成像的結構觀察。非人靈長類ALS 動物模型在各方面優于嚙齒類動物模型，特別是在研究TDP-43 蛋白錯誤積累與錯誤定位和相關蛋白質包涵體方面[33]；在非人靈長類ALS 動物模型大腦中觀察到caspase-4 調節TDP-43 蛋白在胞質中的錯誤定位，而且與嚙齒類動物模型有所不同[34]。非人靈長類ALS動物模型與組織透明化技術結合，易于觀察ALS 中運動神經元的數量變化、變性特點和TDP-43 蛋白的錯誤積累和錯誤定位，從三維可視化角度闡述ALS 的發生發展機制。

（三）MS

MS 是一種進展性、炎癥性脫髓鞘病，累及中樞神經系統多個部位，不同部位發病引起不同的臨床表現，而且反復發作。病理特點是皮質脫髓鞘和神經-軸索、突觸的缺失，靶點是丘腦、海馬等灰質結構。主要臨床表現為反復發作的腦、脊髓和視神經損傷。其中實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是一種廣泛應用于MS 模型的臨床前研究新療法和潛在發病機制[35-37]。

Erturk 等[38]借助3DSICO 研究和測定小鼠脊髓膠質細胞的數目變化，分析脊髓傷后神經膠質細胞反應特點和軸突再生軌跡。Spence 等[39]借鑒改良的CLARITY 方法，研究表明MS灰質萎縮與軸突膨大的數目有關，提供髓鞘再生的治療靶點和策略。有研究發現非人靈長類EAE 動物模型可以彌補嚙齒類動物EAE 模型模型與MS 患者之間的差異，觀察到非人靈長類MS 動物模型白質和灰質中脫髓鞘情況可以初步判斷病情進展，輔助診斷和治療[40-41]。結合組織透明技術觀察非人靈長類MS 動物模型中樞神經系統多個部位的脫髓鞘和神經元、軸突的缺失現象，對研究MS 的整體水平十分重要。

（四）PD

PD 是一種與α-突觸核蛋白基因突變有關的神經退行性疾病，特征性病理改變為黑質多巴胺能神經元進行性退變和路易小體形成，導致紋狀體區多巴胺遞質減少，從而患者出現臨床上最經典的癥狀：靜止性震顫和肢體僵硬[42-44]。

Liu 等[45]應用CLARITY 方法、3D 成像觀察和分析PD 患者組織和小鼠大腦的路易小體形態及其空間定位和單突觸多巴胺能神經元，Menegas 等[46]憑借CLARITY 方法可視化觀察位于小鼠腦中的紋狀體、皮層、杏仁核的單突觸多巴胺能神經元，研究多巴胺神經回路機制。Morissette 和Di Paolo[47]認為非人靈長類PD 動物模型是實驗減少或抑制過表達的α-突觸核蛋白是PD 關鍵的治療靶點的關鍵模型。Seo 等[48]認為1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導引起黑質細胞的大量缺失和存在類路易小體包涵體的慢性非人靈長類PD 動物模型，適合于行為學評價。組織透明化結合非人靈長類PD 動物模型和透明化技術，對闡述多巴胺的功能及其對神經元的作用機制更有利。

三、總結與展望

組織透明化技術在非人靈長類中的應用已有報道，表明其應用于研究非人靈長類動物的神經退行性疾病具有可行性[9-10]。但是，組織透明化技術存在以下技術局限性：（1）熒光蛋白的淬滅。在透明過程中，使用的化學試劑難免會加速熒光蛋白的淬滅，不利于光學成像。因此如何在透明過程減少熒光信號的淬滅、保留蛋白和核酸等的抗原性，還需要進一步的研究；（2）樣本的變形。在透明過程中，化學試劑的作用影響樣本的理化性質，比如親水法和水凝膠法會引起組織擴張，疏水法則會導致組織皺縮，改變了樣本原有的結構信息；（3）光學成像。如何實現樣品大小、信噪比、掃描速度、成像深度和分辨率的高效、靈活配置，適用透明化的完整大型生物體的成像，需要多學科合作。當然亟需改進的方面還有很多，比如透明的過程繁瑣耗時和試劑昂貴不利于推廣使用，透明化組織的保存、數據整理與分析、有機溶劑的毒害性等。

綜上所述，通過對非人靈長類動物神經器官透明化，或將實現3D 觀察和分析非人靈長類結構完整的神經細胞；通過對非人靈長類動物的全身組織器官透明化，進行高通量的3D 成像，有望應用于藥物開發；通過對非人靈長類動物的組織樣本透明化，進行3D 成像，有利于發現更多的疾病相關的細胞，提高實驗診斷的敏感性和準確性。組織透明化技術應用于非人靈長類退行性疾病動物模型的研究，引導人們系統、整體去獲取生物體結構和功能信息，轉化為臨床應用，或將解決許多疑難雜癥。

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