源于間充質干細胞的外泌體與器官移植

孫東，宋紅麗，沈中陽（.天津醫科大學一中心臨床學院，天津 3009；.天津市第一中心醫院器官移植科，天津市器官移植重點實驗室，天津市器官移植臨床醫學研究中心，衛生部危重病急救醫學重點實驗室，中國醫學科學院移植醫學重點實驗室，天津 3009）

器官移植是20 世紀醫學發展中最引人注目的成果之一，在本世紀又得到更快速的發展與更廣闊的應用［1］。然而目前學科面臨的如器官移植后免疫排斥反應、功能損傷等主要問題至今仍未得到滿意的解決，是目前臨床上桎梏器官移植學科發展的重要障礙。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群具有自我更新能力、多向分化潛能的干細胞。其易于獲得、來源豐富，具有強大的免疫調節、減輕組織器官損傷、促進組織修復、誘導新生血管生成等多方面生理學功能，是器官移植領域應用干細胞治療的理想“種子細胞”［2］。但目前臨床應用MSC 面臨著如細胞來源與種類、干預的劑量、途徑以及時機等方案的選擇、移植后的安全性等諸多問題，制約了其臨床應用。外泌體是MSC分泌的細胞介質，其發現不僅加深了對MSC 作用機制的認識，同時也為臨床應用MSC 細胞治療的方案提供了更為廣闊的視野。我們對目前已經闡明的有關MSC 來源外泌體在不同細胞、組織、器官及系統水平上發揮調控功能的相關研究及其機制進行綜述，旨在引起器官移植學者對MSC 來源外泌體的重視，為干細胞治療在器官移植領域的應用提供新的觀點及思路。

1 MSC 及其釋放的外泌體

MSC 具有趨向于受傷部位進行組織修復、傷口愈合、免疫調節等功能，具有免疫豁免的特權，這是其在器官移植領域備受矚目的主要原因之 一［3］。但是直接將MSC 作為干細胞治療的工具仍然面臨著眾多風險。MSC 發揮功能主要依賴其旁分泌功能實現，而非通過定向分化形成新的細胞，其證據是目前MSC 移植后存活率及存活時間均有限，但其治療效果卻可以長期存在［4］。MSC 的旁分泌作用不僅局限于直接釋放細胞因子，同樣依賴于其釋放的外泌體。外泌體中可以包含MSC 等細胞的蛋白質、DNA、信使RNA（mRNA）、微小RNA（MicroRNA，MiR）等細胞質內的多種具有生物學功能或信息傳遞功能的生物分子，是MSC 發揮作用的關鍵作用機制［5-6］。

2 MSC 外泌體作用的分子機制概述

外泌體作為細胞與細胞之間通訊的介質成分，以旁分泌、遠距分泌的形式在細胞間傳播生物信息，在生理及病理狀態下發揮重要的調控作用［7］。MSC 外泌體內具有生物學活性的分子，如蛋白質、DNA、RNA 等成分與含量并非是作為一個特定靜止的群體存在，而是會隨著與細胞狀態、培養環境、提取純化步驟、細胞來源等多種條件的改變而呈動態變化。

非編碼RNA 在體內發揮著重要的調控作用。一般根據序列長度將MSC 外泌體中的非編碼RNA 大致分為MiR 和長非編碼RNA（long-nocoding RNA，LncRNA）。外泌體的體積極小，序列較長的核酸及氨基酸組裝成蛋白等往往難以完整保存，而MiR 因其長度多維持在20 ～24 個核酸之間，在外泌體中更有可能以完整的形式保存下來。因此，在MSC 外泌體的相關機制研究多圍繞MiR 進行。據估計，MiR 參與調節的編碼mRNA 翻譯成的蛋白質約占30%左右，構成了真核生物轉錄組的基礎。MiR 的以組織特異性方式表達，精確并積極地調節參與到細胞的各個過程，其經典調控機制為其在mRNA 轉錄后調節其基因表達水平，從而控制與細胞的發育、分化與其他相關的細胞命運密切相關的關鍵細胞途 徑［8］。目前觀點認為，MSC 外泌體中含有種類繁多的非編碼RNA 在促進愈合與修復等多種作用效果中發揮著重要的調控機制。

2.1 調控干細胞多能性、分化特性：干細胞的分化和譜系決定依賴于遺傳物質與分化細胞之間的雙向相互交流與溝通，受到細胞周期轉運與環境刺激的限制。干細胞來源的外泌體攜帶的遺傳信息［9］。在其中，MSC 外泌體介導的遺傳物質的交流與交換是干細胞生物學信息交換的重要機制，維持并促進了這種遺傳物質的雙向交換，對于維持干細胞本身的正常生理功能，維持細胞存活，調控胚胎及胚胎干細胞多能性、自我更新性與分化性能的平衡，并且在最終分化譜系的決定方面起著重要作用。例如，經MiR-486 修飾的干細胞外泌體可以將遺傳信息攜帶至紅白血病細胞中，使靶細胞內沉默信息調節因子-1 基因表達上調，從而誘導其向紅細胞分化［10］。胚胎干細胞的外泌體同樣可以將MicroRNA 及其他轉錄因子相關的mRNA 傳遞至靶細胞中，開啟早期的向視網膜方向的分化程序［11］。MSC 的分化潛能遠低于胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）及誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPScell），且移植入體內后其分化潛能及自我更新的能力明顯減弱。因此，有觀點認為MSC 發揮作用的方式更多依賴其免疫調節作用，而缺乏另一種重要的修復途徑，即通過分化為特定細胞組織發揮修復損傷的作用，這很大程度上限制了MSC 的修復潛能。MSC 外泌體對干細胞多能性的調控作用或許可以從某一角度加深對MSC 分化潛能的理解，對維持MSC 的干性及調控其分化方向具有一定的意義［12］。

2.2 修復靶細胞器官組織：器官移植后，不可避免地出現移植器官的結構功能損傷。MSC 外泌體具有組織再生與器官保護等多項生物學作用。研究表明，MSC 及其來源的外泌體修復靶器官的作用圍繞著多種機制，如調控靶細胞增殖、促進血管生成、抑制上皮間充質轉化等［13］。

2.2.1 優化基質成分并抑制上皮間充質轉化：基質中內皮細胞的增殖與激活是修復過程中的關鍵環節。MSC 外泌體可以激活基質中成纖維細胞合成膠原以優化基質成分，支持組織的修復與愈合。該過程的作用機制通過MSC 外泌體將攜帶的MiR-125a 傳遞至內皮細胞，通過下調血管生成抑制δ因子樣4促進內皮細胞的增殖及血管生成［14］。此外，MSC 外泌體在傷口愈合期間通過抑制周邊細胞內轉化生長因子蛋白-β/SMAD 家族蛋白2（TGF-β/SMAD2）通路，抑制其向肌成纖維細胞方向分化，同時促進內皮細胞增殖及成纖維細胞活化［15］。

MSC 外泌體不僅調控內皮細胞與成纖維細胞的增殖與活化同時還可以抑制其上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程。成纖維細胞增殖可以促進基質重塑有助于組織修復，但是過量的成纖維細胞可能會導致組織增厚反而出現抑制修復過程的現象［16］。研究表明，使用MSC外泌體可以有效抑制TGF-β 處理過的近端腎小管上細胞E-鈣粘蛋白的表達，緩解EMT 現象，從而有效保護腎臟功能［17］。在體內，骨髓MSC 外泌體同樣可以抑制EMT 從而發揮修復作用，且在年輕腎臟中比老年腎臟中明顯活躍，提示MSC 外泌體具有潛在的修復衰老腎臟纖維化的作用［18］。

2.2.2 抑制靶細胞組織凋亡：MSC 外泌體具有抑制靶細胞凋亡，促進靶細胞存活從而改善器官功能。例如，單獨使用MSC 產生的外泌體可以將抗凋亡的MicroRNA 傳遞至受損的心肌細胞，繼而在心肌細胞中轉錄，從而抑制受損心肌細胞中的促凋亡基因的表達，促進細胞存活，增強血管生成，最終改善心肌細胞的功能，且其保護作用甚至優于直接應用MSC 進行細胞治療［19］。Wang 等［20］人進一步對不同MSC，如來源于骨髓內容物的MSC、來源于脂肪組織的間充質干細胞（adipose derived-MSC，AD-MSC）、來源于子宮內膜的間充質干細胞（endometrial MSC， EnMSC）對心臟的保護作用進行了比較，結果顯示EnMSC 修復效果顯著優于其他兩種細胞，其原因在于EnMSC 外泌體中高表達的MiR-21 可能是其發揮抑制靶細胞凋亡的關鍵分子。MiR-181-5p 修飾的AD-MSC 通過外泌介導轉移至受損的肝細胞，激活肝細胞內的自噬系統并下調信號傳導及轉錄激活因子3、B 淋巴細胞瘤-2、纖粘蛋白、膠原蛋白Ⅰ、波形蛋白及α-平滑肌肌動蛋白等分子表現出肝臟保護作用［21］?？傊?，MSC 外泌體可以通過MicroRNA 傳遞遺傳信息是MSC 發揮抑制凋亡的修復作用的重要機制之一。

2.2.3 促進靶細胞增殖：MSC 外泌體可以誘導靶細胞增殖，從而促進組織再生［22］。動物實驗表明，來源自人滑膜MSC 的外泌體中豐富的MiR-140-5p 能夠調節基質細胞的成脂肪方向/成骨方向的平衡，通過上調β-連環蛋白（β-catenin）/Wnt 通路，阻斷基質成分分泌，促進基質細胞向軟骨組織轉化，有效預防大鼠膝關節炎的發生［23］。MiR-126是參與心肌細胞內糖酵解途徑、支持心肌組織耐受缺氧應激的關鍵分子，而經葡萄糖處理過的MSC，其釋放的外泌體中MiR-126 顯著降低［24］。這不但解釋了高糖條件或糖尿病患者體內MSC 修復血管內皮能力的降低，同時闡釋了糖尿病患者冠心病發病率高、預后差的部分原因［25］。在常規治療很難干預的神經組織中，MSC 外泌體中的MicroRNA 傳遞至神經細胞后也可以表現出神經保護功能以及促進神經再生的作用。AD-MSC 外泌體中的LncRNA轉移相關肺腺癌轉錄-1 通過調節蛋白激酶Cδ Ⅱ剪接促進神經再生和增強的神經元存活［26］。更為有趣的是，衰老小鼠的下丘腦中干細胞、祖細胞大量喪失，而補充了年輕健康小鼠下丘腦中的干細胞的衰老小鼠，其衰老年齡與壽命顯著延后，該過程中同樣有腦脊液中的干細胞來源的外泌體中MicroRNA 與抗衰老因子的參與［27］。

2.3 免疫調節以提供理想的免疫微環境：免疫排斥反應是限制器官移植術預后的重要原因，也是亟待解決的難題。而MSC 的免疫調節功能是其備受器官移植專家青睞的重要原因。研究表明，炎癥環境可以影響外泌體內蛋白、核酸等生物分子的特性及表達量，反之干細胞也可以借助外泌體傳遞MicroRNA 等遺傳信息有效調控炎癥反應的發 生［28］。例如臍帶間充質干細胞來源的外泌體中含有 的MiR-21、MiR-146a、MiR-181 在 組 織 修 復過程中發揮免疫調節的作用［29］。使用炎性因子對MSC 進行預處理可以明顯增強MSC 的免疫調節功能，同樣體現在MSC 來源的外泌體中MicroRNA的 表 達 譜 上［30］。 例 如，MSC 對 白 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的預處理后，其免疫調節功能得以激活。其后進一步影響巨噬細胞，導致巨噬細胞向M2 方向（即抗炎方向）極化，使得巨噬細胞抗炎性因素增強，促炎性因素減弱［31］。而這一現象可能與外泌體中的MiR-146a 顯著上調有關。下調MiR-146a 的表達可以抑制IL-1β 預處理的MSC 外泌體的免疫調節作用［32］。這表明IL-1β 預處理的MSC 通過改變其外泌體中MiR-146a 的表達量增強其免疫調節功能。這為臨床應用干細胞治療提供了新的思路，即對MSC 的預處理后的免疫調節功能的增強與其分泌的外泌體直接相關。MSC 外泌體通過傳遞其內攜帶的MicroRNA等遺傳信息，有效發揮其免疫調節功能，為組織修復過程提供理想的免疫微環境。

3 MSC 外泌體在器官移植領域的研究及前景

圍繞器官移植的背景，美國內布拉斯加醫學中心大學專家Mahato 等［33］率先將人骨髓間充質干細胞進行修飾，使其過表達可以抑制脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，Fas）表達的干擾RNA 及抑制MiR-375 表達的反義RNA。與外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）共培養過程中將外泌體傳遞至胰島移植術后大鼠模型體內，顯著下調了該大鼠體內Fas 及MiR-375 的表達水平，繼而通過PBMC 增殖及增強調節性T 細胞功能，表現出顯著的改善胰島移植術后的免疫耐受狀態的免疫調節功能。該研究表明在器官移植領域中，MSC 借助外泌體發揮出免疫調節的作用，有望成為該領域研究的熱點方向。

目前，對MSC 外泌體直接應用于器官移植的研究尚不成熟。但現有的研究提示我們，MSC 在器官移植領域有著廣闊的應用前景。以肝移植領域為例，MSC 外泌體具有的免疫調節、組織修復與促血管生成作用是其堅實的機制基礎［34］。Lai 等［35］通過向發生移植物抗宿主病模型大鼠體內注射MSC 外泌體，可顯著抑制Th-17 和Treg 細胞的活性，減輕免疫排斥反應及病理損傷。Jiang 等［36］的研究表明MSC 外泌體通過減少氧化應激、抑制肝細胞凋亡，減輕四氯化碳誘導的肝纖維化。此外，有研究表明將MSC 外泌體注射到肝癌小鼠體內時，借助其內豐富的抗腫瘤的MiR-122 等多種生物學分子，有效抑制腫瘤生長，提高化療敏感性，說明MSC 外泌體可能特別適用于肝癌肝移植的患者［37］。

4 總 結

MSC 在器官移植領域的作用已經得到基礎研究的證實并逐步推向臨床，具有廣闊的應用前景。與直接移植MSC 比較，外泌體的體積更小、結構更簡單、穩定性更強，更易在統一標準下獲取與保存，應用更為方便，有專家甚至提出了“cell-free therapy（無細胞參與）”的干細胞治療策略。相信隨著干細胞與臨床醫學專家對MSC 外泌體相關研究的深入，終將實現成熟的干細胞治療方案，對器官移植事業的發展起到重要的促進作用。