祛風消癜合劑UHPLC指紋圖譜的建立

凌 霄 張 輝 李偉霞牛 璐唐進法*任獻青

（1.河南中醫藥大學第一附屬醫院，中藥臨床評價技術河南省工程實驗室，河南鄭州 450000；2.河南中醫藥大學，呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南鄭州 450006；3.河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科，河南鄭州 450000）

過敏性紫癜常見于兒童,相當一部分患兒由于其反復發作而引起腎臟病變等其他嚴重并發癥［1-2］,故研發合適的藥物以降低該疾病發病率、預防重要器官損傷是亟需解決的問題。研究表明,風熱傷絡證是過敏性紫癜常見證型［3］,針對其特征,河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科專家根據長期臨床經驗總結研制了祛風消癜方,由忍冬藤、荊芥、防風、徐長卿、茜草、海風藤、丹參、炙甘草組成,方中忍冬藤善于清熱疏風通絡,荊芥長于透疹止血,共為君藥；防風祛風止癢,海風藤深入經絡,祛除風邪,共為臣藥；配以徐長卿祛風止癢,丹參祛瘀生新、涼血活血,茜草涼血止血、化瘀通經,共為佐藥；甘草瀉火解毒、調和諸藥,為使藥,諸藥相伍,用于過敏性紫癜辨證屬風熱傷絡者,其療效顯著,不良反應?。?-5］。祛風消癜合劑是在祛風消癜方基礎上開發的院內制劑,本實驗建立其UHPLC指紋圖譜,以期為全面評價和控制其質量提供依據。

1 材料

XS105型電子天平 （十萬分之一,瑞士Mettler-Toledo公司）；UHPLC-Q-TOF-MS系統,配置ACQUITY-UHPLC型高效液相色譜儀、電噴霧離子源XEVO-G2XSQTOF飛行時間質譜、Acquity UHPLC H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

馬錢苷 （純度＞98%,批號R23D7F27552）、5-O-甲基維斯阿米醇苷 （純度＞98%,批號P05M8F35478）、原兒茶醛 （純度＞98%,批號P05M7F14533）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；新綠原酸 （純度 ＞ 98%,批號lw190124015）對照品購于南京良緯科技有限公司；甘草苷（純度＞98%,批號PRF8110742）對照品購于成都普瑞法科技開發有限公司；綠原酸（純度96.8%,批號110753-201817）、槲皮苷（純度90.6%,批號111538-201606）、橙皮苷 （純度96.2%,批號110721-201818）、丹酚酸B （純度96.6%,批號111562-201917）、丹皮酚 （純度99.8%,批號110708-201908）、甘草酸銨 （純度97.7%,批號110731-201720）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

祛風消癜合劑共12批,均由醫院制劑室制備（批號分 別為 20181124、20181127、20181201、20190311、20190315、20190328、20191118、20191215、20200121、20200206、20200208、20200301）,編號S1～S12。忍冬藤（批號1809080172）購于湖北天濟中藥飲片有限公司；荊芥（批號1805282）、防風（批號1807171）、徐長卿 （批號1804112）、海風藤（批號1805192）、丹參（批號1807231）均購于安徽普仁中藥飲片有限公司；茜草（批號180916）、炙甘草（批號180916）均購于安徽人民中藥飲片有限公司,經河南中醫藥大學第一附屬醫院藥檢室施鈞瀚副主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UHPLC CSH C18色譜柱 （2.1 mm×100 mm,1.7 μm）；流動相0.2%磷酸（A）-乙腈（B）,梯度洗脫（0～5 min,5%B；5～30 min,5%～22%B；30～45 min,22%～95%B；45～47 min,95% B；48～50 min,95%～5%B）；體積流量0.3 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長236 nm；進樣量1 μL。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）,正、負離子掃描模式；毛細管電壓2 500 V；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣溫度250 ℃,體積流量600 L/h；離子源溫度100 ℃,錐孔氣體積流量50 L/h；亮氨酸-腦啡肽（正離子模式m/z556.277 1,負離子模式m/z554.261 5）溶液在線校正,掃描質量100～1000 Da,全掃描模式。采用Waters UNIFI軟件對采集數據進行處理。

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液 取馬錢苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、原兒茶醛、新綠原酸、甘草苷、綠原酸、槲皮苷、橙皮苷、丹酚酸B、丹皮酚、甘草酸銨對照品各約1 mg,精密稱定,甲醇制成1 mg/mL貯備液,再進一步稀釋至0.05 mg/mL,即得。

2.3.2 供試品溶液 精密吸取12批樣品,每批2 mL,甲醇定容至10 mL量瓶中,超聲提取20 min,各吸取10 mL至離心管中,150 000 r/min離心5 min,取上清液,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 按照處方比例及工藝流程,制備缺忍冬藤、缺荊芥、缺防風、缺徐長卿、缺茜草、缺海風藤、缺丹參、缺炙甘草的陰性樣品,按“2.3.2” 項下方法制備,即得。

2.3.4 單味藥材溶液 按照處方比例,稱取忍冬藤、荊芥、防風、徐長卿、茜草、海風藤、丹參、炙甘草8種單味藥材,按“2.3.2” 項下方法制備,即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液（S4）,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6次,以14號峰（升麻素苷）為對照,測得各共有峰相對峰面積RSD為1.17%～2.86%,相對保留時間RSD為0.03%～0.82%,表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液（S4）,分別于0、3、6、12、18、24 h,在“2.1”項色譜條件下進樣測定,以14號峰（升麻素苷）為對照,測得各共有峰相對峰面積RSD為1.02%～2.92%,相對保留時間RSD為0.03%～1.11%,表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取合劑（S4）6份,按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進樣測定,以14號峰（升麻素苷）為對照,測得各共有峰相對峰面積RSD為1.19%～2.82%,相對保留時間RSD為0.04%～1.52%,表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜建立 取12批樣品,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,將所得圖譜以CDF格式導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012版）進行分析,自動多點匹配法生成對照圖譜,計算相似度,結果見圖1、表1。由此可知,各批樣品相似度均大于0.97；有24個共有峰,分離度均大于1.5,其中14號峰（升麻素苷）峰面積較高,出峰時間穩定適中,分離度良好,故選擇其作為對照峰。各共有峰相對保留時間RSD為0.05%～1.15%,總體上較穩定；相對峰面積RSD為3.83%～29.62%,上下浮動較大,表明個別成分在不同批次樣品中的含有量有較大差異。

圖1 12批樣品UHPLC指紋圖譜Fig.1 UHPLC fingerprints for twelve batches of samples

表1 12批樣品相似度Tab.1 Similarities of twelve batches of samples

2.6 共有峰指認和歸屬 將對照品、供試品溶液色譜圖疊加,比對兩者保留時間,指認出4、5、8、10、14、15、17、18、19、22、23、24號峰分別為新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、馬錢苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲維阿斯米醇苷、槲皮苷、橙皮苷、丹酚酸B、丹皮酚、甘草酸,見圖2。

對其余未指認出的共有峰,在分離后不經檢測器而直接接取其出峰時間前0.5 min至出峰時間后0.5 min的洗脫液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定10次,于氮氣流下吹干,殘留物用200 μL甲醇復溶,渦流2 min,15 000 r/min離心10 min,上清液采用UHPLC-TOF-MS法進行分析,通過Waters UNIFI軟件對所采集數據進行處理,將碎片離子信息與對照品圖譜和相關文獻作比對,其裂解規律見圖3,鑒定結果見表2。

圖2 各成分UHPLC色譜圖（Ⅰ）Fig.2 UHPLC chromatograms of various constituents （Ⅰ）

圖3 各成分質譜裂解規律Fig.3 MS fragmentation patterns for various constituents

表2 未知共有峰鑒定結果Tab.2 Results of unknown common peak identification

由此可知,3號峰一級質譜準分子離子峰為m/z179.034 8 ［M-H］-,苯環上鄰二酚羥基脫水后生成碎片離子m/z161,再脫羧失去CO2,生成碎片離子m/z135,與對照品和文獻［6-7］比對后推測其為咖啡酸；11號峰一級質譜準分子離子峰為m/z403.124 5 ［M-H］-,脫去一分子葡萄糖后生成碎片離子m/z223,再脫去一分子CO2和乙酰氧基,生成碎片離子m/z121,與對照品和文獻［8］比對后推測其為斷氧化馬錢苷；21號峰一級質譜準分子離子峰為m/z461.072 9 ［M-H］-,從苷鍵處脫去一分子葡萄糖醛酸,生成碎片離子m/z285,與對照品和文獻［9］比對后推測其為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；20號峰一級質譜準分子離子峰為m/z359.076 9 ［M-H］-,酰氧鍵斷裂,生成碎片離子m/z179,苯環上鄰二酚羥基脫水,生成碎片離子m/z161,與對照品和文獻［10］比對后推測其為迷迭香酸；7號峰一級質譜準分子離子峰為m/z477.081 2 ［M-H］-,脫去一分子糖苷,生成碎片離子m/z315,與對照品和文獻［11］比對后推測其為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

將單味藥材、陰性樣品溶液色譜圖進行比對,發現各藥材色譜峰均與合劑共有峰對應,表明單味藥材與合劑化學信息的相關性良好。其中,1、3、4、6、9、10、11、13號峰歸屬于忍冬藤,12號峰歸屬于海風藤,14、17號峰歸屬于防風,15、24號峰歸屬于炙甘草,19號峰歸屬于荊芥,21、22號峰歸屬于丹參,23號峰歸屬于徐長卿；2號峰為荊芥、丹參、防風共有,18號峰為丹參、忍冬藤共有,5號峰為荊芥、忍冬藤、丹參共有,20號峰為荊芥、丹參共有,7號為忍冬藤、茜草共有,8號為忍冬藤、荊芥共有,16號峰為防風、炙甘草共有。色譜圖見圖4。

圖4 各成分UHPLC色譜圖（Ⅱ）Fig.4 UHPLC chromatograms of various constituents （Ⅱ）

2.7 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）采用PLS-DA對24個共有峰的相對峰面積進行判別分析,得分圖 ［R2X（cum）=0.87,Q2（cum）=0.964］見圖5,可知12批樣品可按生產年份聚為3類,即2018年產（S1～S3）、2019年產（S4～S8）、2020年產（S9～S12）；載荷圖見圖6,可知11、16、7、6、1、22、4、15、8、13、19、18、21號峰的圓形距離原點較遠,表明這些成分對分組貢獻較大；VIP見圖7,可知大于1的有10種,分別為5號峰（原兒茶醛）、2號峰、18號峰（槲皮苷）、21號峰（木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）、19號峰（橙皮苷）、15號峰（甘草苷）、22號峰（丹酚酸B）、13號峰、4號峰（新綠原酸）、1號峰,但其相對峰面積均在2018年產樣品中最低,而18、21、19、15、13號峰在2019年產樣品中最高,5、2、22、4號峰在2020年產樣品中最高。綜上所述,造成不同年份樣品質量差異的主要成分為槲皮苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B、新綠原酸、13號峰、1號峰。

圖5 12批樣品PLS-DA得分圖Fig.5 PLS-DA score plot for twelve batches of samples

3 討論

圖6 12批樣品PLS-DA載荷圖Fig.6 PLS-DA loading plot for twelve batches of samples

圖7 共有峰相對峰面積VIP圖Fig.7 VIP diagram for relative peak areas of common peaks

本實驗對色譜條件進行了考察,發現Waters ACQUITY UHPLC CSH C18色譜柱 （2.1 mm ×100 mm,1.7 μm）分離效果最好；乙腈-0.2% 磷酸洗脫時各成分色譜峰分離度較好,出峰時間適中；不同柱溫（25、30、35 ℃）差別不大；體積流量0.3 mL/min時洗脫效果最好；采用DAD檢測器在190～400 nm波長處進行掃描,發現236 nm處色譜峰數量最多,峰高度合適,故選擇其作為檢測波長。再對供試品溶液制備方法進行了考察,發現超聲提取效果明顯優于冷浸,而且15 mL甲醇提取20 min時,只需1次各成分即已基本提取完全。

本實驗建立了祛風消癜合劑UHPLC指紋圖譜,確定了24個共有峰的藥材來源歸屬和其中17個的化學成分歸屬,但海風藤、茜草信號較弱,專屬峰較少,將在今后研究中加以改進。PLS-DA顯示,不同年份樣品在整體質量上存在一定差異,原兒茶醛、槲皮苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B、新綠原酸可作為差異標志物,其中原兒茶醛、新綠原酸、丹酚酸B相對峰面積隨著貯藏時間延長逐漸降低。新綠原酸、原兒茶醛是君藥忍冬藤標志性成分,具有較好的抗氧化、抗炎作用,但其結構中有酯鍵、不飽和雙鍵、多元酚等不穩定部分［12-13］；丹酚酸B具有較強的抗氧化、清除自由基作用,是臣藥丹參重要功效成分,但其性質也不穩定［14-15］,這些化合物含有量差異可能是造成不同年份樣品質量存在差異的主要原因之一,提示祛風消癜合劑在貯藏過程中需要關注成分的穩定性。因此,建議對祛風消癜合劑進行品質評價時應增加新綠原酸、原兒茶醛、丹酚酸B等穩定性較差成分的含有量測定,以期最大程度保證該制劑質量。