養心氏片對心肌梗死后抑郁大鼠的影響

姜 兵，吳若銘，張 聰，鐘孝正，洪 毅，沈曉燕*

（1.復旦大學藥學院藥理系，上海 201203；2.上海醫藥集團股份有限公司中央研究院，上海 201203；3.上海醫藥集團青島國風藥業股份有限公司，山東青島 266510）

抑郁癥是一種異質性疾病,導致這種疾病的確切神經機制尚未被發現。抑郁癥是一個日益嚴重的全球性問題,并一直與冠心?。╟oronary heart disease,CHD）的風險增加有關［1-2］。抑郁癥與增加CHD風險的確切機制是復雜的、多因素的,目前還不完全清楚。CHD患者的抑郁癥發病率是普通人群的2～3倍,約為15%～30%,女性約為男性的2倍,急性心肌梗死 （myocardial infarction,MI）后的年輕女性尤其受影響［3-4］。抑郁癥是冠心病的一個危險因素,其特征是從輕微的抑郁癥狀到臨床診斷的嚴重抑郁癥,抑郁癥和冠心病發病率的流行病學研究顯示較高水平的抑郁癥狀與較高的風險相關［2］。

養心氏片由13種中草藥（黃芪、黨參、丹參、葛根、淫羊藿、山楂、地黃、當歸、黃連、醋延胡索、靈芝、人參、炙甘草）組成,功效為益氣活血、化瘀止痛。適于氣虛血瘀所致的胸痹,癥見心悸氣短、胸悶、心前區刺痛,廣泛用于臨床治療冠心病。臨床研究表明,養心氏片可以促進經皮冠狀動脈介入治療后的康復,并降低心血管事件的發生率［5］。根據臨床觀察,養心氏片能夠改善冠心病合并抑郁狀態［6］。多項Meta分析結果表明,養心氏片在治療冠心病心絞痛、心律失常以及慢性心力衰竭上具有較高安全性［7］,并且能提高常規西藥治療的療效［8］。本研究對養心氏片治療心肌梗死后合并抑郁癥大鼠的藥效進行觀察,并探討相關機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 養心氏片（0.6 g/片,批號150505）購自上海醫藥集團青島國風藥業股份有限公司；鹽酸氟西汀片購自常州四藥制藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液購自江西科倫藥業有限公司；水合氯醛、羧甲基纖維素鈉購自國藥集團；TRIzol、RT Reagents、SYBR mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DEPC購自碧云天生物技術研究所；TNF-α 試劑盒、IL-1β 試劑盒、IL-6試劑盒購自上海達科為生物技術有限公司；5-HT試劑盒、CORT試劑盒、ACTH試劑盒、NE試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器 基因擴增儀購自美國BIO-RAD公司；超微量分光光度計購自中國上海寶予德有限公司；酶標儀購自瑞士Tecan Systems Inc公司；心電監護儀SMUP-PC購自中國上海嘉龍教儀廠；小動物呼吸機購自中國北京中西化玻儀器有限公司；小動物超聲機Vevo 2100 lmaging System購自加拿大Visual Sonics公司。

1.3 動物 50只SD雄性大鼠（180～220 g）購自上海斯萊克實驗動物有限公司,動物生產許可證號SCXK （滬）2012-0002。大鼠飼養于復旦大學SPF級別動物房中,可以自由食用無菌食物和水。所有動物操作程序均符合中國動物福利法和復旦大學實驗動物倫理委員會的有關規定。動物倫理批準號2018-10-YL-SXY-01。

2 方法

2.1 分組 50只大鼠隨機分為假手術組、模型組（等體積0.5% CMC-Na）、氟西汀組（10 mg/kg）、養心氏片低劑量和高劑量組（500、1 000 mg/kg）,每組10只,灌胃給藥4周,1次/d。將大鼠飼養于SPF級動物房中,正常提供食物和水,保證12 h光照周期。

2.2 造模及給藥 使用10% 水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉。將大鼠置于手術臺上固定,連接心電圖監護系統,并記錄術前心電圖,大鼠胸前左側至腋窩處手術備皮,仰臥位固定于手術臺上,75%酒精消毒手術視野。經氣管切開插管,以專用小動物呼吸機行正壓人工呼吸,打開胸腔暴露心臟,輕輕將心臟包膜分離用醫用棉棒挑起左心耳,暴露左心耳與肺動脈圓錐之間的結扎區域。用6～0的醫用縫合針線在離左心耳與肺動脈圓錐交接處2 mm左右永久性結扎左冠狀動脈前降支。觀察心電圖變化,顯示ST段抬高≥0.15 mV,并且心臟出現因缺血而致的顏色改變,結扎成功,用醫用棉球和棉棒清除胸腔內積血。觀察呼吸情況良好,對好肋間肌肉和肋骨,縫合胸腔,假手術組僅穿過左冠狀動脈前降支而不結扎,其余操作與梗死組動物相同,手術后將大鼠單籠飼養。造模成功后進行強迫游泳誘發抑郁癥［9］。大鼠心外膜顏色的改變證實了心臟缺血。完成手術造模的第2天,評估心梗以確認心肌梗死造模成功。通過行為學實驗來評價大鼠抑郁程度,包括糖水消耗、游泳不動時間以及曠場運動評估抑郁癥狀造模成功。大鼠在胸部和皮膚閉合及拔管后返回籠中恢復7 d后,進行強迫游泳誘發抑郁癥,游泳結束后的第2天進行行為學評價。大鼠在確認心梗模型造模成功后,開始給藥,大鼠心肌梗死后抑郁模型的造模周期為10 d。在進行造模前,假手術組、模型組、氟西汀組、養心氏片低劑量和高劑量組,每組分別為12只大鼠,心梗造模過程中,假手術組、模型組分和氟西汀組別各死亡1只大鼠,養心氏高劑量組死亡2只大鼠；在抑郁造模過程中,模型組和養心氏低劑量組各死亡1只大鼠。最終每組選擇10只大鼠進行后續的實驗以及數據分析。

2.3 心臟彩超檢測 造模成功后,每組中的10只大鼠進行超聲心動圖檢測,利用小動物超聲機記錄左室收縮末期容積（LVESV）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室舒張期內徑（LVIDd）、左室收縮期內徑 （LVIDs）等,并計算左室射血分數（EF%）和左室短軸縮短率（FS%）。

2.4 蔗糖水偏好測試 實驗前在安靜的房間內,訓練動物適應含糖飲水,每籠同時放置2個水瓶,第一個24 h內,2瓶均盛1% 蔗糖水,隨后的24 h,一個瓶盛1%蔗糖水,另一個瓶盛純水。禁食禁水24 h后,每只大鼠給予事先定量好的2瓶水：一瓶1%蔗糖水,一瓶純水,1 h后,取2瓶水稱量。計算大鼠的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗。糖水偏愛=（糖水消耗/總液體消耗）×100%。

2.5 強迫游泳實驗 將大鼠單個放入水深為25 cm的塑料圓筒中 （高45 cm,直徑30 cm）,水溫25 ℃,時間共6 min,前2 min作為大鼠適應階段,后4 min納入不動狀態的時間統計。

2.6 曠場實驗 根據大鼠穿越底面方格塊數作為水平活動得分,以直立次數作為垂直活動得分,水平和垂直活動得分總和為總評分。敞箱裝置為長寬各100 cm （底面被等分為25個等邊方格）、高50 cm各面漆黑的箱子。將大鼠放入中心格內,觀察大鼠在3 min內穿越格數（四爪均進入的方格才記數,為水平運動得分）、后肢直立次數（兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運動得分）。

2.7 血清中生物標志物的測定 按照相應的ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α （腫瘤壞死因子-α）、IL-1β （白細胞介素-1β）、IL-6 （白細胞介素-6）、5-HT （5-羥色胺）、CORT （血清皮質酮）、ACTH （釋放促腎上腺皮質激素）、NE（去甲腎上腺素）水平。

2.8 RT-PCR檢測 稱取海馬適量置于1.5 mL離心管中,加入TRIzol 1 mL室溫靜置5 min后,加入200 μL氯仿,劇烈震蕩15 s后靜置2 min,4 ℃、12 000 g離心15 min,吸取上清置于新的1.5 mL離心管中,加入異丙醇500 μL,室溫放置10 min,4 ℃、12 000 g離心10 min,加入1 mL 75%乙醇,4 ℃、7 500 g離心5 min,棄上清,晾干后加入20 μL DEPC水溶解。將提取的RNA逆轉錄為cDNA,加入正反向引物進行擴增。引物由上海生工工程有限公司合成,序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

3 結果

3.1 養心氏片改善心肌梗死后抑郁大鼠的心臟功能 表2、圖1顯示,與假手術組比較,模型組中的大鼠心功能嚴重受損,主要表現為LVIDd、LVIDs和LVEDV、LVESV增大（P＜0.01）,FS和EF減?。≒＜0.01）；與模型組比較,養心氏片能夠改善心臟功能（P＜0.05,P＜0.01）。

3.2 養心氏片緩解心肌梗死后大鼠的抑郁癥 表3～5顯示,與假手術組比較,模型組中的大鼠不論是對于糖水的偏好（P＜0.01）,強迫游泳中運動時間（P＜0.01）,曠場實驗中運動得分（P＜0.05）都下降。與模型組比較,氟西汀組大鼠的以上指標均有改善（P＜0.05,P＜0.01）,顯示建模成功。與模型組比較,養心氏片組中大鼠的糖水偏好（P＜0.05）,曠場實驗中運動得分（P＜0.05）上升；強迫游泳中的不動時間下降（P＜0.01）,顯示養心氏片能夠有效緩解大鼠心肌梗死后的抑郁癥狀。

表2 超聲心動圖的血流動力學參數比較（， n=10）Tab.2 Comparison of hemodynamic parameters of echocardiography in rats of each group （， n=10）

表2 超聲心動圖的血流動力學參數比較（， n=10）Tab.2 Comparison of hemodynamic parameters of echocardiography in rats of each group （， n=10）

注：與假手術組比較,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

圖1 各組大鼠心臟彩超圖Fig.1 Cardiac color Doppler ultrasonography of rats in each group

表3 各組大鼠糖水消耗比較（， n=10）Tab.3 Comparison of sucrose preference in rats of each group （， n=10）

表3 各組大鼠糖水消耗比較（， n=10）Tab.3 Comparison of sucrose preference in rats of each group （， n=10）

注：與假手術組比較,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05。

表4 各組大鼠游泳不動時間比較（， n=10）Tab.4 Comparison of immobility time of rats in each group （， n=10）

表4 各組大鼠游泳不動時間比較（， n=10）Tab.4 Comparison of immobility time of rats in each group （， n=10）

注：與假手術組比較,**P＜0.01；與模型組比較,##P＜0.01。

表5 各組大鼠曠場實驗運動得分比較（， n=10）Tab.5 Comparison of open-field exercise scores of rats in each group （， n=10）

表5 各組大鼠曠場實驗運動得分比較（， n=10）Tab.5 Comparison of open-field exercise scores of rats in each group （， n=10）

注：與假手術組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

3.3 養心氏片降低心肌梗死后抑郁大鼠的炎癥水平 圖2顯示,與假手術組比較,模型組大鼠血清中的炎癥因子TNF-α （P＜0.01）、IL-1β （P＜0.01）、IL-6 （P＜0.05）水平上升。與模型組比較,養心氏片高劑量組大鼠血清的TNF-α （P＜0.01）、IL-1β （P＜0.05）、IL-6 （P＜0.05）下降,表明養心氏片能夠有效降低心肌梗死后抑郁大鼠的炎癥水平。

3.4 養心氏片上調心肌梗死后抑郁大鼠的單胺神

經遞質水平 圖3顯示,與假手術組比較,模型組中大鼠血清中5-HT （P＜0.01）、ACTH （P＜0.01）、CORT （P＜0.01）、NE （P＜0.01）下降,與模型組比較,氟西汀組（P＜0.05）與養心氏片高劑量組（P＜0.05,P＜0.01）大鼠的上述血清標志物升高。

3.5 養心氏片降低模型大鼠海馬區的炎癥水平及

圖2 養心氏片對大鼠血清炎癥因子水平的影響Fig.2 Effects of Yangxinshi Tablets on serum inflammatory factors levels in rats

圖3 養心氏片對大鼠血清單胺神經遞質水平的影響Fig.3 Effects of Yangxinshi Tablets on serum monoamine neurotransmitters levels in rats

抑制犬尿酸通路限速酶的表達 圖4～5顯示,與假手術組比較,模型組中大鼠TNF-α（P＜0.01）及IL-6 （P＜0.01）mRNA表達上升。與模型組比較,養心氏片高劑量組大鼠TNF-α（P＜0.05）及IL-6 （P＜0.01）mRNA表達下降。對于犬尿酸通路中限速酶,養心氏片對IDO1、 KMO、 KYNUmRNA表達與TNF-α、IL-6呈現出相同的趨勢（P＜0.05）。表明養心氏片能夠有效降低心肌梗死后抑郁大鼠海馬區的炎癥水平并抑制犬尿酸通路中限速酶的表達。

4 討論

在冠心病患者中,抑郁與功能損害的嚴重程度、治療的依從性和心臟康復的參與度降低有關。多項薈萃分析為臨床抑郁癥（狀）與冠心病之間的關聯提供了證據［10-11］。盡管研究結果存在一些異質性,但大部分證據支持這樣一種觀點,即急性冠脈綜合征（acute coronary syndromes,ACS）后抑郁是全因和心臟死亡率的危險因素,以及包括死亡率或非致命性心臟事件在內的復合終點［3］。中國的一項前瞻性隊列研究,對633例非阻塞性冠狀動脈（MINOCA）患者進行3年隨訪,顯示抑郁與全因死亡率和心血管事件的顯著相關性［12］。在冠心病患者中,抑郁癥狀是生活質量（QoL）的最強預測因子［13］。抑郁癥不僅獨立于CHD的嚴重程度與日常生活心絞痛相關,而且相較于冠狀動脈疾病或其他傳統風險指標更能預測心絞痛的嚴重程度［14］。本研究的實驗結果顯示,養心氏片能夠有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心臟功能,同時明顯緩解抑郁癥狀。

圖4 養心氏片對大鼠海馬區炎癥因子的影響Fig.4 Effects of Yangxinshi Tablets on inflammatory factor in hippocampus of rats

圖5 養心氏片對大鼠海馬區犬尿酸通路限速酶表達的影響Fig.5 Effects of Yangxinshi Tablets on the expression of rate-limiting enzyme in kynurenine pathway in rat hippocampus

抑郁癥和較差的冠心病預后之間的潛在機制是復雜的,多因素的?？挂钟羲幾饔糜诖竽X中的5-羥色胺,多巴胺和去甲腎上腺素系統以及其他神經遞質回路,包括選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑,三環抗抑郁藥,5-羥色胺去甲腎上腺素再攝取抑制劑以及其他作用機制的抗抑郁藥。但是,這些藥物同樣引起心血管不良反應,如QT間期的延長、低血壓、心律失常和出血風險增加等［15］。

一個與抑郁癥相關的冠心病風險增加的假設機制是慢性炎癥,這是動脈粥樣硬化和冠心病發展的已知風險因素［16］。作為心血管疾?。╟ardiovascular diseases,CVD）結果的預測因子,IDO1的過度表達伴隨著色氨酸（tryptophan,TRP）分解代謝的增加被證明可由慢性系統性低度炎癥（chronic systemic low-grade inflammation,CSLGI）引起［17］。作為控制Trp分解代謝速率的限速酶,IDO1可被干擾素和白細胞介素等促炎細胞因子激活［18］。抑郁癥與持續的炎癥狀態和增加的炎癥因子濃度有關,如TNF-α、IL-1β 和IL-6,對心臟和循環有已知的不良影響［19］。在臨床上,炎癥被認為是抑郁患者的潛在病因和治療目標［19］。本實驗證實養心氏片能夠有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能和抑郁癥狀,同時顯著降低大鼠血清中炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和海馬區的炎癥（TNF-α、IL-6）水平。

由于犬尿氨酸（kynurenin,KYN）途徑的代謝分流導致可用于血清素（5-HT）合成的TRP的減少被認為是抑郁癥可能的病理生理機制［20］。研究證實抑郁癥中存在促炎狀態,IDO1參與KYN介導的代謝分流,加速TRP的消耗并且促進TRP代謝為KYN［21］。一項廣泛的隊列研究顯示IDO1活性與動脈粥樣硬化初始階段和頸動脈中膜厚度增加呈正相關［22］。人體內的KYN及其代謝產物3-羥基犬尿氨酸 （3-hydroxykynurenine,3HK）、喹啉酸（quinolinic acid,QUIN）和犬尿喹啉酸（kynurenic acid,KYNA）的水平與抑郁癥密切相關［23］。這些化合物具有導致抑郁的作用,包括調節神經細胞死亡,谷氨酸轉移和神經炎癥［24］。在促炎條件下,KYN與神經炎癥有關,并被認為有助于抑郁癥的發病機制［24］。與健康對照受試者比較,抑郁癥患者的血漿KYNA和KYNA/KYN比率顯著降低,且接受6周選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRI）治療可顯著增加首發抑郁癥的初治患者的KYNA/KYN比率［25］。臨床實驗結果顯示,SSRI抗抑郁藥艾司西酞普（escitalopram）可通過抑制具有神經毒性的犬尿氨酸代謝物的合成而發揮其抗抑郁作用,并且通過減少炎癥反應來發揮其抗抑郁作用［26］。本實驗發現,養心氏片能夠有效地改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能和抑郁癥狀,并且顯著上調單胺神經遞質水平。同時,養心氏片能夠有效降低大鼠海馬區中炎癥水平和抑制犬尿酸途徑中限速酶（IDO1、KMO和KYNU）的表達。

以上證據表明,炎癥增強以及相關的KYN代謝失衡可能是CVD和抑郁癥共有的病理生理機制。因此,抗炎治療、抑制KYN的代謝途徑同時增加單胺神經遞質的利用,為冠心病合并抑郁癥患者治療提供了可能的策略。目前的抗抑郁西藥均能夠透過血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）,直接作用于腦部。但是中藥成分復雜,多數活性成分溶解性較差。本實驗結果表明,養心氏片可以通過減輕炎癥反應、抑制犬尿氨酸途徑、增加單胺神經遞質,同時改善心肌梗死后抑郁大鼠的心功能以及抑郁癥狀,以期為養心氏片治療心血管疾病合并抑郁癥的臨床應用提供實驗依據,也為中藥“腦病外治”“心腦同治” 提供參考。