珍寶丸聯合電針對急性脊髓損傷大鼠行為學和BrdU、Nestin、GFAP表達的影響

賴增嬌，滕秀英，劉國斌

（1.內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古通遼 028000；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱 150001；3.內蒙古通遼市科爾沁區第一人民醫院，內蒙古通遼 028000）

急性脊髓損傷是臨床常見的急重癥,多發生于交通事故、高處墜落等事故中,可影響肢體功能,甚至可導致癱瘓。調查［1］顯示,全球急性脊髓損傷的發病率約為每百萬人中有3.6～195例,且該病的發生率仍逐漸增長,由此所致的肢體運動障礙和死亡人數也越來越多,已引起高度重視。目前臨床上對此類患者多采用減壓手術或營養脊髓神經、促脊髓神經生長等保守治療,有一定療效,但仍存在較大的提升空間。蒙藥珍寶丸具有安神活絡、清熱涼血等功效,在既往研究中被證實對急性脊髓損傷具有輔助治療作用［2］,可改善患者的康復效果,且在動物實驗中也證實該藥物可改善急性脊髓損傷大鼠模型的行為學［3］。電針是基于經絡學說的一種脈沖電刺激療法,可改善血流、增強損傷的脊髓神經的自我修復功能,還可改善患者的運動功能［4］。有研究［5-7］提示,5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、巢蛋白 （Nestin）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達是脊髓神經細胞生長、增殖和分化的重要參考指標,在急性脊髓損傷后上述指標表達均有所升高以促進脊髓神經細胞的生長、增殖和分化,加快損傷組織修復,已被作為急性脊髓損傷的治療靶點應用于動物實驗中［8］。為嘗試探討增療效的方案,本研究特嘗試將蒙藥珍寶丸與電針聯用治療急性脊髓損傷大鼠,并觀察其效果,探討對脊髓損傷組織BrdU、Nestin、GFAP表達的影響。

1 材料

1.1 動物 45只成年SD大鼠,雌雄各半,無特定病原體（SPF）級,10周齡,體質量180～230 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號SCXK （京）2018-0001。

1.2 藥物與試劑 蒙藥珍寶丸（內蒙古蒙藥股份有限公司,國藥準字Z1502410,規格6 g/丸,批號171205003）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術研究所,批號1706135A）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標記（TUNEL）染色試劑盒（美國Roche公司,批號1710178）；兔抗鼠血管性血友病因子（vWF）、BrdU、Nestin、GFAP單克隆抗體和山羊抗兔vWF、BrdU、Nestin、GFAP多克隆抗體（辣根過氧化物酶標記）（美國Abcam公司,批號1710115002、1711125001、1711017010、1710018007、1710014007、1712017008、1712151002、1711019004）；RNAiso Plus提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司,批號1710145001）；BrdU、Nestin、GFAP、內參（βactin）引物委托深圳晶美生物技術有限公司合成；蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司,批號170812）。

1.3 儀器 G-6805型電針治療儀（北京科苑達醫療器械有限公司）；不銹鋼打擊桿（天津州杰技術發展有限公司定制）；Magnetion （德國西門子公司）；CH20 BIM型光學顯微鏡、BX63型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；7500型聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司）；Allegra X-15R型低溫高度離心機（美國Beckman公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型蛋白質凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠系統成像分析軟件（美國Alpha公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 取45只SD成年大鼠隨機分為正常對照組、模型組、丸劑組、電針組、聯合組。以水合氯醛腹腔注射麻醉,仰臥位固定大鼠于手術臺上,常規術前準備,沿著T7～T11椎體中線做縱行切口,切開2 cm,逐層切開皮膚和椎旁肌肉,注意避免損傷血管,接著切除T8～T10棘突和椎板,沖洗傷口后壓迫止血。取10 cm不銹鋼打擊桿垂直下降擊打暴露脊髓中心的位置,注意每只大鼠建模時打擊高度需一致,均為10 cm,打擊物質量為10 g。建模后出現痙攣性擺尾反射,雙后肢回縮性撲動,遲緩性癱瘓［9］,即為造模成功。與此同時,正常對照組僅暴露脊髓,無擊打操作。

2.2 治療 丸劑組予以蒙藥珍寶丸治療,取蒙藥珍寶丸以開水浸泡,制作懸液,劑量0.54 g/kg,溶于1 mL/100 g大鼠體質量的溫開水中灌胃,于術后23 h予以治療,此后每間隔24 h給藥1次,共1周；電針組予以電針干預,選取大椎穴（位于第7頸椎和第1胸椎間背部正中）、命門穴（位于第2腰椎棘突下）,大椎穴向下斜刺、命門穴向上斜刺,分別接入陽極、陰極,持續脈沖電流刺激,于術后23 h予以治療,針刺30 min,留針30 min,此后每間隔24 h治療1次,共1周；聯合組予以蒙藥珍寶丸聯合電針治療,具體方法分別同丸劑組、電針組。

2.3 治療前后行為學 分別于治療前（確認建模成功后,正常對照組同一時刻）、治療后采用后肢運動功能評分（Basso Beattie Bresnahan,BBB）量表評價［10］,評分范圍為0～21分,0分表示后肢完全無活動,21分表示后肢活動完全正常,運動功能評分量表評分越高認為行為學越佳,每只大鼠均評價3次,每2次時間間隔至少5 min,求平均值。

2.4 治療后損傷脊髓組織病理變化和脊髓細胞凋亡率 采用HE染色法觀察損傷脊髓組織病理變化,采用TUNEL法檢測脊髓細胞凋亡率。常規腹腔麻醉,取T11～T13段損傷部位的脊髓組織,留取樣本,保存于-80 ℃的超低溫冰箱中。取1 mg組織固定、沖洗、脫水,二甲苯透明處理后石蠟包埋,制作石蠟切片,層厚4 μm,嚴格按照HE染色法試劑盒操作,最后以中性樹膠封固,于光學顯微鏡下觀察病理變化。將無明顯神經細胞損傷劃為0級,將有散在、輕微神經細胞損傷劃為1級,將有片狀神經細胞損傷劃為2級,將有嚴重神經細胞損傷劃為3級。同法取組織制作石蠟切片,嚴格按照TUNEL檢測試劑盒操作,于光學顯微鏡下隨機取5個不重復的視野計算陽性染色細胞率,即為脊髓細胞凋亡率。

2.5 治療后損傷區域血管生成 采用免疫熒光染色法檢測。取待檢測組織,脫水包埋,液氮速凍,切片后平鋪于防脫載玻片上。室溫下干燥,于搖床上振搖清洗3次,5 min/次,透膜后采用PBS清洗3次,5 min/次。加入2 mol/L鹽酸溶液,孵育30 min、37 ℃。加入0.1 mmol/L硼酸鈉溶液,中和反應10 min,采用PBS清洗3次,5 min/次。以10%濃度小牛血清蛋白封閉,加入一抗（兔抗鼠vWF單克隆抗體）,濕盒孵育,4 ℃過夜,PBS清洗后加入二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔vWF多克隆抗體）,濕盒孵育,37 ℃、1 h,PBS清洗。吹干,封片,4 ℃避光,干燥后以熒光顯微鏡采集圖像,統計vWF陽性血管數目。

2.6 損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達 采用逆轉錄實時熒光定量PCR檢測。同法取組織,采用RNAiso Plus提取總RNA,配置反應體系,共10 μL,逆轉錄合成cDNA。以β-actin為內參,取待檢測基因的上下游引物配置反應體系,共25 μL,實施PCR反應,反應體系為95 ℃預變性30 s,95 ℃ （5 s）、60 ℃ （30 s）,共40個循環,最后55 ℃ （90 s）。對擴增產物實施凝膠電泳驗證,并繪制溶解曲線,采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達采用Western blot法檢測。取組織,液氮冷凍,加入經過預冷處理的裂解液,冰上快速勻漿并裂解1 h。將產物離心分析,并進行蛋白變性、電泳、轉膜、標記處理。加入一抗（1 ∶1 000）,濕盒孵育,4 ℃過夜,PBS沖洗3次,5 min/次；加入二抗（1 ∶5 000）,室溫孵育1 h,PBS沖洗3次,5 min/次。計算目的蛋白的相對表達量。

2.8 統計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析,計量資料以（）表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,配對t檢驗檢測本組內治療前后資料。檢驗標準為α=0.05。

3 結果

3.1 治療前后各組行為學 40只建模大鼠中共有33只建模成功,7只死亡,推測由于脊髓損傷過重所致,建模成功率為82.50% （33/40）,將建模成功大鼠隨機分為模型組（8只）、丸劑組（8只）、電針組（9只）、聯合組（8只）。治療前模型組BBB評分低于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯合組均與模型組相近（P＞0.05）,治療后模型組BBB評分較治療前下降（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯合組BBB評分均較治療前升高（P＜0.01）；治療后組間BBS評分比較,模型組低于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯合組均高于模型組（P＜0.01）,聯合組高于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖1。

圖1 治療前后各組行為學Fig.1 Behavior of each group before and after treatment

3.2 治療后各組損傷脊髓組織病理變化和脊髓細胞凋亡率 正常對照組大鼠神經元細胞結構完整、形態正常,灰質未見彌漫性水腫；模型組可見脊髓灰質有大量、較大空泡形成,脊髓組織的正常結構被破壞,白質中可見神經膠質細胞大量增生,受損的脊髓白質區域內可見嚴重微囊性病變,且神經元細胞可見嚴重的崩解、核碎裂表現,大量炎性細胞浸潤；丸劑組和電針組可見脊髓灰質有部分、大空泡形成,白質可見神經膠質細胞增生,受損的脊髓白質區域內可見微囊性病變,且部分神經元細胞可見崩解、核碎裂表現,部分炎性細胞浸潤；聯合組可見脊髓灰質少量、大空泡形成,白質可見較少神經膠質細胞增生,受損的脊髓白質區域內可見較少微囊性病變,較少神經元細胞可見崩解、核碎裂表現,少量炎性細胞浸潤。見圖2。

圖2 各組損傷脊髓組織病理變化（HE，×40）Fig.2 Pathological changes of spinal cord injury tissue in each group （HE，×40）

治療后模型組損傷脊髓組織分級高于正常對照組（P＜0.05）,丸劑組、電針組和聯合組均低于模型組（P＜0.05）,且聯合組低于丸劑組、電針組（P＜0.05）。見表2。治療后模型組損傷脊髓細胞凋亡率高于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯合組損傷脊髓細胞凋亡率均低于模型組（P＜0.01）,且聯合組損傷脊髓細胞凋亡率低于丸劑組、電針組 （P＜0.01）。見圖3。

3.3 治療后損傷區域血管生成 治療后模型組vWF陽性血管數目多于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯合組vWF陽性血管數目均多于模型組（P＜0.01）,且聯合組vWF陽性血管數目多于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖4～5。

表2 各組損傷脊髓組織病理分級（）Tab.2 Pathological grade of spinal cord injury tissue in each group （）

表2 各組損傷脊髓組織病理分級（）Tab.2 Pathological grade of spinal cord injury tissue in each group （）

注：與正常對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05；與丸劑組比較,&P＜0.05；與電針組比較,￥P＜0.05。

圖3 各組治療后損傷脊髓細胞凋亡率Fig.3 Post-treatment apoptosis rates of spinal cord injury tissue cells in each group

3.4 治療后各組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、GFAPmRNA表達 治療后模型組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達均高于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯合組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達均高于模型組（P＜0.01）,且聯合組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達均高于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖6。

圖4 vWF陽性血管數目（免疫熒光染色，×100）Fig.4 Number of vWF positive blood vessel （immunofluorescence staining，×100）

圖5 各組治療后vWF陽性血管數目Fig.5 Post-treatment number of vWF positive vessels in each group

3.5 治療后各組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達 治療后模型組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達均高于正常對照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯合組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達均高于模型組（P＜0.01）,且聯合組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達均高于丸劑組、電針組 （P＜0.01）。見圖7～8。

4 討論

急性脊髓損傷后,局部神經細胞會出現某些病理性變化,如新血管生成、干細胞被激發并向損傷部位遷移等,可以為損傷組織的修復創造有利條件。但是在此過程中,由于某些因素出現拮抗作用,影響損傷脊髓組織的自我修復,如興奮性氨基酸的毒性作用、自由基大量產生、損傷所致的嚴重炎癥反應等［11-12］。Wan等［13］研究指出,急性脊髓損傷后常規的治療措施難以達到理想的效果,患者往往需要較長時間的恢復過程,且肢體功能受損嚴重,給患者的生活質量造成極大的影響。故而該領域工作者需積極探討新的治療方案促進急性脊髓損傷患者脊髓功能快速恢復,改善療效。

圖6 各組治療后損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達Fig.6 Post-treatment expressions of BrdU， Nestinand GFAPmRNA in spinal cord injury tissue of each group

圖7 Western blot檢測各組治療后損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達Fig.7 Detection of post-treatment expressions of BrdU，Nestin and GFAP proteins in spinal cord injury tissue of each group by Western blot

圖8 各組治療后損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達Fig.8 Post-treatment expressions of BrdU，Nestin and GFAP proteins in spinal cord injury tissue of each group

神經行為學功能障礙是急性脊髓損傷的共同特性,已成為臨床醫師關注的重點問題。本研究中模型組BBB評分顯著下降,遠不如正常對照組,而丸劑組、電針組和聯合組治療后BBB評分均升高且均高于模型組,聯合組BBB評分明顯高于丸劑組和電針組,提示蒙藥珍寶丸、電針治療急性脊髓損傷均可改善急性脊髓損傷大鼠的神經行為學功能,且蒙藥珍寶丸聯合電針的效果更佳。根據蒙醫理論,急性脊髓損傷屬于白脈病,可出現水腫、血液循環障礙和神經損傷等表現,從而損傷白脈,需針對病因實施治療。蒙藥珍寶丸具有清熱除濕、舒筋活絡、安神寧心等功效,對白脈病療效理想?，F代藥理研究發現,蒙藥珍寶丸不僅有助于增強受損的脊髓神經細胞的自我修復功能,改善局部微循環,還可清除氧自由基、控制炎癥反應,最終達到加快急性脊髓損傷恢復的目的［14-15］。電針刺激大椎穴和命門穴可舒筋活絡、疏通血脈,濡養經脈氣血,在外力損傷督脈所致的氣血逆亂、瘀阻經絡病癥中療效確切。陳溫慈等［16］研究表明,電針刺激急性脊髓損傷大鼠的大椎穴和命門穴可溫煦氣血,濡養肢體筋脈,疏利關節,益氣活血。因此將蒙藥珍寶丸與電針刺激大椎穴和命門穴聯用治療急性脊髓損傷可獲得理想的效果。本研究中病理學觀察、分級和脊髓細胞凋亡率對比結果也顯示丸劑組、電針組和聯合組均較模型組顯著改善,提示蒙藥珍寶丸聯合電針治療急性脊髓損傷效果良好,可減輕病理學改變程度,減少脊髓細胞凋亡,提示該方案具有較高的臨床應用價值。

急性脊髓損傷后新血管生成是快速恢復的有利條件,而其中與相關信號通路的調控關系緊密,可增加vWF表達,促進新血管生成。BrdU屬于一種胸腺脫氧核苷類似物,在細胞增殖周期S期可整合進入細胞核的脫氧核糖核苷酸中,可反映細胞增殖狀態,其表達越高意味著細胞增殖越快,從而為新血管的生成提供條件［17］。Nestin屬于一種中間絲類型蛋白,主要在神經上皮干細胞特異性表達,可促進神經元分化,增強損傷的脊髓神經細胞的自我修復作用,在急性脊髓損傷患者治療中可將其作為靶點,上調其表達以改善脊髓功能。GFAP可與肌動蛋白、細胞膜相結合,增強脊髓神經細胞的遷移和黏附能力,并且還與蛋白激酶有密切關系,可共同參與脊髓損傷細胞的修復和功能改善［18］。有研究［19-21］顯示,急性脊髓損傷大鼠中損傷的脊髓組織中UrdU、Nestin和GFAP均較正常大鼠高表達,而予以對癥治療可上調其表達,提示在急性脊髓損傷治療中應上調UrdU、Nestin和GFAP表達,以改善脊髓功能。本研究中,模型組vWF陽性血管數目、損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA及蛋白表達均顯著高于正常對照組,提示機體的自我修復機制可能啟動,進而保證急性脊髓損傷的恢復,但其作用不甚理想,遠不如丸劑組、電針組和聯合組,且聯合組的作用最佳,表明蒙藥珍寶丸、電針夾脊穴和命門穴均可刺激急性脊髓損傷大鼠新血管生成,上調損傷的脊髓組織中BrdU、 Nestin、GFAPmRNA及蛋白表達,從而發揮加快恢復的作用。

綜上所述,蒙藥珍寶丸、電針治療急性脊髓損傷大鼠均可改善其行為學、減輕病理損傷,并且均可促進新血管生成,二者聯用的效果明顯優于單獨應用,且很可能是通過上調損傷脊髓組織的BrdU、Nestin、GFAP表達實現此作用的。本研究為蒙藥珍寶丸聯合電針在急性脊髓損傷患者臨床治療中的應用奠定了基礎,提供了一種高效可行的治療方案,但該方案對損傷脊髓組織的BrdU、Nestin、GFAP表達上調的具體機制尚不明確,仍需進一步研究探討,以加深人們對其認識,更好地在臨床中推廣使用。