鴨跖草鎮痛活性部位篩選及作用機制研究

李祖成，王 月，趙 峰，王原超，楊 茗，李淑翠，王垣芳*

（1.濱州醫學院基礎醫學院，山東煙臺 264003；2.濱州醫學院藥學院，“方劑效應與臨床評價”國家中醫藥管理局重點研究室，山東煙臺 264003；3.濱州醫學院臨床醫學院，山東煙臺 264003）

疼痛是許多疾病的常見癥狀,也是機體在受到傷害性刺激或損傷時產生的一種保護性的病理反應。劇烈的疼痛不僅給患者造成痛苦,嚴重時可導致生理功能紊亂,甚至引起休克。目前臨床應用的鎮痛藥主要包括非甾體類抗炎藥和阿片類藥物,非甾體類抗炎藥主要適用于治療輕、中度的慢性疼痛,但長期應用消化道不良反應發生率較高,有些新型的非甾體類抗炎藥物甚至可引起嚴重的皮膚反應和急性心血管不良事件；阿片類鎮痛藥鎮痛活性強,但因易導致依賴性、成癮性,其臨床應用受到嚴格限制,主要用于治療急性劇烈疼痛和晚期癌癥疼痛。因此,尋找和研發毒副作用小的鎮痛藥是多年來醫藥界關注的重要課題,從傳統中藥中尋找鎮痛活性成分也成為近年來的熱點之一。

中藥鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草 （Commelina communisL.）的全草,其性寒,味甘、淡,具有清熱解毒、利水消腫之功效,用于治療跌打損傷、筋骨疼痛、小便淋漓作痛、風熱感冒、高熱不退、咽喉腫痛、癰腫疔毒等病癥［1-2］。研究發現,鴨跖草中含有黃酮類、生物堿類、萜類、甾醇類等多種化合物［3-4］。但是對于鴨跖草鎮痛作用有效部位及鎮痛作用機制研究尚未見報道。本研究采用輻射熱刺激甩尾法、醋酸扭體法觀察鴨跖草不同提取部位對小鼠的鎮痛作用,以探究其鎮痛活性部位,并通過阿片受體阻斷試驗和檢測疼痛部位組織中的炎癥因子探討其鎮痛作用機制,旨在為鴨跖草的進一步開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級昆明種小鼠,雌雄各半,體質量（20±2）g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,實驗動物生產許可證號 SCXK （魯）20140007,動物合格證號37009200012102。動物適應性飼養3 d,實驗藥前及實驗過程中均全價顆粒飼料喂養,自由飲水,晝夜明暗交替時間12 h/12 h,實驗室溫度為25 ℃,相對濕度為40%。

1.1.2 藥物與試劑 鴨跖草（安徽易元堂中藥飲片科技有限公司,批號20150410）；阿司匹林腸溶片（每片100 mg,石藥集團歐意藥業有限公司,批號286160208）；鹽酸曲馬多緩釋片（每片100 mg,萌蒂［中國］制藥有限公司,批號10100706,成人單劑量50～100 mg）；鹽酸納洛酮注射液（規格2 mL ∶2 mg,批號20150906,成都苑東藥業有限公司）。小鼠組織前列腺E2（PGE2）酶聯免疫檢測試劑盒（批號20160530）、小鼠組織腫瘤壞死因子-α （TNF-α）酶聯免疫檢測試劑盒（批號20160530）和小鼠組織白介素-6（IL-6）酶聯免疫檢測試劑盒（批號20160530）,均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 SW-200光熱尾痛測試儀（成都泰盟科技有限公司）；BIO-RAD iMark酶標儀（美國BIO-RAD公司）；UV-1901臺式高速微量離心機（北京科普順科技有限公司）；AN1574電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；KQ-400數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 鴨跖草不同提取部位的制備 稱取鴨跖草4.5 kg,粉碎制成粗粉,浸泡2 h,以70%乙醇進行回流提取1 h,連續3次,將3次的提取液合并,回收溶劑,減壓濃縮直至無醇味,干燥后得鴨跖草浸膏49.85 g。將浸膏按硅膠與浸膏3 ∶1的比例混合攪勻,然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水進行萃取,減壓,干燥,直至無溶劑殘留,得到石油醚提取部位（27.16 g）、乙酸乙酯提取部位（2.67 g）、正丁醇提取部位（7.28 g）和水溶部位（30 g）,計算各提取部位與生藥的比值,臨用前用蒸餾水配制成適當質量體積濃度的混懸液,置于冰箱4 ℃保存備用。

2.2 鴨跖草不同部位的鎮痛作用

2.2.1 輻射熱刺激甩尾法測定痛閾值［5］昆明種小鼠140只,雌雄各半,體質量（20±2）g,按性別分籠,每籠10只,自由采食飲水。小鼠在實驗室適應7 d后,隨機分為14組,即生理鹽水組,鹽酸曲馬多組（0.013 g/kg）,鴨跖草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位高、中、低劑量組 （30、15、7.5 g生藥量/kg）,給各鼠按0.1 mL/10 g灌胃,每天1次,連續7 d。

灌胃給藥前,將小鼠置入固定筒內,尾部暴露于外,實驗前先用75%酒精擦凈尾部,在尾部中下1/3處做標記作為光輻射刺激點,然后將尾部標記對準光熱尾痛測試儀的光輻射孔,待小鼠安靜后測定甩尾潛伏期（光強75%）3次,每次間隔5 min,取3次的平均值作為基礎痛閾值。末次給藥后1 h,測試各小鼠給藥后的痛閾值。

2.2.2 醋酸扭體法測定痛閾值［5-6］昆明種小鼠140只,雌雄各半,體質量（20±2）g,按性別分籠,每籠10只,自由采食飲水。小鼠在實驗室適應7 d后,隨機分為14組,即生理鹽水組,阿司匹林組（0.5 g/kg）,鴨跖草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g生藥量/kg）,給各鼠按0.1 mL/10 g灌胃,每天1次,連續7 d。末次給藥后1 h,給各鼠腹腔注射0.6%醋酸0.4 mL,觀察并記錄各鼠扭體反應的潛伏期和15 min內扭體反應的次數。

2.3 鴨跖草鎮痛有效部位的作用機制

2.3.1 阿片受體阻斷試驗 經過上述實驗即可篩選出鴨跖草的鎮痛活性部位為水溶部位。昆明種雌性小鼠,體重（22±2）g,采用熱板法［5］（55±1）℃篩選痛閾值相近的小鼠30只,隨機分為3組,即1組（生理鹽水/納洛酮組）、2組（鴨跖草水溶部位/生理鹽水組）、3組（鴨跖草水溶部位/納洛酮組）,每組10只。2、3組分別灌服鴨跖草水溶部位（相當于生藥30 g/kg）,1組灌服等量的生理鹽水,每天1次,連續7 d,末次給藥45 min后進行如下處理。

鴨跖草水溶部位/生理鹽水組：腹腔注射生理鹽水0.1 mL/10 g進行預處理,15 min后再次灌服鴨跖草水溶部位；鴨跖草水溶部位/納洛酮組：用納洛酮0.1 mL/10 g（5 mg/kg）腹腔注射進行預處理,15 min后再次灌服鴨跖草水溶部位；生理鹽水/納洛酮組：腹腔注射生理鹽水進行預處理,15 min后注射納洛酮（劑量同前）；末次給藥1 h后再次進行熱板試驗,記錄舔后足潛伏期作為痛閾值（超過60 s者均按60 s計算）。

2.3.2 福爾馬林致痛試驗局部組織中炎癥因子含有量測定

昆明種雌性小鼠,體質量（22±+2）g,隨機分為6組,即生理鹽水組,阿司匹林組（500 mg/kg）,鹽酸曲馬多組（0.013 g/kg）,鴨跖草水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g生藥量/kg）,每組10只,連續灌胃給藥7 d。末次給藥1 h后,于小鼠右足底皮下注射5%福爾馬林25 μL,然后放置于懸掛的1 000 mL燒杯內,觀察第一時相（0～10 min）和第二時相（15～30 min）舔咬右后足次數［5,7］。福爾馬林試驗結束后6 h,將小鼠頸椎脫臼處死,剪取腫脹右足底組織并稱定質量,按質量容積比1 ∶9 （1 g ∶9 mL）的比例加生理鹽水,研磨成勻漿,于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液,ELISA測定PGE2、TNF-α 和IL-6含有量。

3 結果

3.1 鴨跖草不同部位的鎮痛作用

3.1.1 鴨跖草提取部位對小鼠輻射熱刺激痛反應的影響各給藥組的給藥前痛閾值（輻射熱刺激甩尾潛伏期）與生理鹽水組比較無顯著性差異（P＞0.05）。與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠給藥后痛閾值明顯增大（P＜0.01）；與自身給藥前及生理鹽水組比較,鴨跖草石油醚提取部位高劑量組（30 g/kg）和水溶部位高、中、低劑量組（30、15、7.5 g/kg）痛閾值有不同程度增大 （P＜0.05,P＜0.01）,尤以水溶部位高、中劑量組最為顯著（P＜0.01）。見表1。

3.1.2 鴨跖草不同提取部位對小鼠醋酸扭體反應的影響與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠扭體次數減少、扭體反應潛伏期延長（P＜0.01）；鴨跖草石水溶部位高、中、低劑量組小鼠扭體次數減少,扭體反應潛伏期延長（P＜0.05,P＜0.01）,其中水溶部位高、中劑量組扭體次數顯著減少,扭體反應潛伏期顯著延長（P＜0.01）,見表2。

3.2 鴨跖草鎮痛有效部位的作用機制

3.2.1 納洛酮對鴨跖草水溶部位鎮痛作用的影響 鴨跖草水溶部位/生理鹽水組小鼠給藥后的痛閾值增大,即舔足潛伏期延長,與自身給藥前基礎痛閾值比較有顯著性差異（P＜0.01）；與生理鹽水/納洛酮組比較有顯著性差異（P＜0.05）；與鴨跖草水溶部位/生理鹽水組比較,鴨跖草水溶部位/納洛酮組小鼠舔足潛伏期縮短（P＜0.05）；與自身給藥前基礎痛閾值比較,鴨跖草水溶部位/納洛酮組小鼠舔足潛伏期延長（P＜0.05）。見表3。

表1 鴨跖草不同提取部位對小鼠輻射熱刺激痛反應的影響（， n=10）

表1 鴨跖草不同提取部位對小鼠輻射熱刺激痛反應的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與自身給藥前比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

表2 鴨跖草不同提取部位對小鼠醋酸扭體反應的影響（， n=10）

表2 鴨跖草不同提取部位對小鼠醋酸扭體反應的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

表3 納洛酮對鴨跖草水溶部位鎮痛作用的影響（，n=10）

表3 納洛酮對鴨跖草水溶部位鎮痛作用的影響（，n=10）

注：與生理鹽水/納洛酮/組比較,*P＜0.05；與鴨跖草水溶部位/生理鹽水組比較,△P＜0.05；與自身給藥前基礎痛閾值比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

3.2.2 鴨跖草水溶部位對小鼠福爾馬林致痛的影響 與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠在第一時相（0～10 min）舔咬右后足次數無明顯減少 （P＞0.05）,在第二時相（15～30 min）舔咬右后足次數減少（P＜0.01）；鹽酸曲馬多組小鼠在第一相和第二相舔咬右后足次數均減少（P＜0.01）；鴨跖草水溶部位各劑量組小鼠在第一時相和第二時相舔咬右后足次數均減少（P＜0.01,P＜0.05）,且呈劑量依賴性。見表4。

表4 鴨跖草水溶部位對小鼠福爾馬林致痛的影響（，n=10）

表4 鴨跖草水溶部位對小鼠福爾馬林致痛的影響（，n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

3.2.3 鴨跖草水溶部位對炎癥因子的影響 與生理鹽水組比較,阿司匹林組小鼠右足底局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低（P＜0.05,P＜0.01）；鴨跖草水溶部位高、中劑量組小鼠右足底局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低（P＜0.05,P＜0.01）,其中以高劑量組的含有量降低最明顯（P＜0.01）,見表5。

表5 鴨跖草水溶部位對炎癥因子的影響（， n=10）

表5 鴨跖草水溶部位對炎癥因子的影響（， n=10）

注：與生理鹽水組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

4 討論

疼痛是機體受到傷害性刺激和發生炎癥反應時所伴隨的癥狀,一般分為急性傷害性疼痛、炎癥性疼痛和神經病理性疼痛［8］。一定強度的熱刺激引起的疼痛為急性傷害性疼痛［6］。小鼠尾部對熱刺激特別敏感,當受到一定強度的熱刺激時,痛覺信號傳導至神經中樞,再反饋到運動系統即可出現甩尾的保護性反應,因此熱刺激時小鼠出現甩尾的潛伏期可反映痛閾值［5］。醋酸扭體法是通過給小鼠腹腔注射一定容積和濃度的醋酸,刺激腹膜引起炎性疼痛,從而出現扭體反應,該反應在注射15 min內出現頻率最高,故以注射15 min內發生扭體反應的次數或發生反應的潛伏期作為疼痛指標［5,9］。

本實驗結果表明,鴨跖草水溶部位可明顯提高小鼠熱刺激痛閾值,減少小鼠醋酸致痛的扭體反應次數；石油醚提取部位高劑量具有一定的提高痛閾值作用,而石油醚提取部位中、低劑量和乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位各劑量均無明顯作用,提示鴨跖草的水溶性部位為鴨跖草的鎮痛活性部位。

福爾馬林致痛試驗是目前國際公認的用于研究藥物鎮痛作用的常用方法［10］,適用于篩選鎮痛作用較弱的藥物,其致痛刺激較為持久,且疼痛反應的兩個時相分別代表不同性質的疼痛。第一時相（0～10 min）反應為福爾馬林直接刺激傷害性感受器,引起C纖維興奮而出現急性傷害性疼痛,其特點為短暫的急痛反應,表現為舔足、縮足或抬足反射等行為反應；第二時相（15～30 min）反應則是由于第一階段引起的中樞敏化和外周炎癥共同參與所致［10-12］。本實驗結果顯示,鴨跖草水溶部位對小鼠福爾馬林致痛試驗的第一時相和第二時相反應均有抑制作用,提示鴨跖草水溶部位對傷害性刺激引起的急性傷害性疼痛和炎癥反應引起的炎性疼痛均有抑制作用。

TNF-α、IL-6、PGE2是重要的致炎因子。組織損傷時,受損的組織細胞和免疫細胞可釋放TNF-α、IL-6和PGE2等炎癥介質,引起炎癥反應和疼痛［13-15］；PGE2還可直接刺激痛覺感受器引起疼痛［6］。本實驗結果顯示,給小鼠足底注射福爾馬林可引起局部組織中PGE2、TNF-α 和IL-6釋放增加,表明注射部位發生了炎癥反應；鴨跖草水溶部位能使局部組織PGE2、TNF-α 和IL-6含有量降低,且呈劑量相關性,提示鴨跖草水溶部位具有抑制炎癥反應和減輕炎性疼痛的作用。

阿片受體是內源性阿片肽和阿片類藥物產生鎮痛作用的重要靶點。納洛酮為阿片受體拮抗劑,可競爭性拮抗阿片肽和阿片類藥物的鎮痛作用［16-17］。本實驗結果表明,納洛酮能使鴨跖草水溶部位的鎮痛作用有所減弱,提示鴨跖草水溶部位的鎮痛作用機制可能部分與激動阿片受體有關。

本研究結果提示,鴨跖草的水溶部位為鴨跖草的鎮痛活性部位,對于傷害性疼痛的鎮痛作用可能與阿片受體有關；對于炎癥性疼痛的鎮痛作用可能與減少前列腺素等致炎因子有關。