芪藶強心膠囊對急性心腎綜合征模型大鼠心腎功能的影響

嚴鳳琴，朱 虹，吳欽欽，胡紅玲，卜曉芬，明小燕，賀映俠

（華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院全科醫學科，湖北武漢 430014）

心腎綜合征（cardiorenal syndrome,CRS）是指心腎功能在病理生理上的紊亂,常由一個器官的急性或慢性病變導致另一個器官的急性或慢性病變的臨床綜合征。臨床上心、腎疾病常常并存,急（慢）性心臟疾病可直接導致或加劇急（慢）性腎功能惡化,急劇腎功能下降也可增加心衰和心梗發生風險［1］。心、腎疾病共存可顯著增加患者的病死率和致殘率［2］。目前,如何保護和改善CRS患者的腎功能仍是一個難題。芪藶強心膠囊作為一種傳統中藥復方制劑,早于2004年就被我國食品藥品監督管理局批準用于心衰的治療,目前在臨床上廣泛應用于心血管疾病的治療。有研究表明,芪藶強心膠囊能明顯改善老年CRS患者心腎功能,并改善其臨床癥狀［3-4］。目前,針對芪藶強心治療CRS的機制研究還不夠完善,為了進一步探討芪藶強心改善CRS腎臟功能的作用機制,本研究擬采用左冠狀動脈前降支結扎結合腎臟急性缺血再灌注損傷的方法建立CRS大鼠模型,并探討芪藶強心對CRS大鼠腎功能改善及腎組織氧化損傷的影響,以期為其臨床應用提供更充分的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物 芪藶強心膠囊購自于石家莊以嶺藥業股份有限公司（批號A1705005）,稱取芪藶強心顆粒12 g,加入30 mL生理鹽水溶解,配成400 g/L溶液。

1.2 動物 SPF級健康、雄性SD大鼠80只,體質量220～250 g,購自于武漢大學動物實驗中心,動物生產許可證號：SCXK （鄂）2017-0018。飼養環境保持晝夜12 h光照,恒溫25 ℃,空氣濕度40%～70%,通風良好,自由飲食。

1.3 試劑 大鼠尿微量白蛋白（MAU）酶聯免疫吸附測定試劑盒（貨號E-EL-R0025c）、大鼠中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）酶聯免疫吸附測定試劑盒（貨號E-EL-R0662c）、大鼠胱抑素C （Cys-C）酶聯免疫吸附測定試劑盒（貨號E-EL-R0304c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；肌酐 （Cre）測定試劑盒 （貨號C011-2）購自南京建成生物工程研究所；逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白質濃度測定試劑盒購自武漢阿斯本生物技術有限公司；NADPH氧化酶2 （NOX2）單克隆抗體 （貨號ab129068）購自英國Abcam公司；GAPDH單克隆抗體（貨號#2118）購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標記的二抗山羊抗兔IgG （貨號SA00001-2）購自武漢三鷹生物技術有限公司；活性氧ROS檢測熒光探針DHE （貨號為活性氧ROS檢測熒光探針DHE）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備 采用左冠狀動脈前降支結扎結合腎臟急性缺血再灌注損傷制備CRS。按40 mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后,腹部備皮,碘伏消毒,正中切開,沿腹白線進入腹腔,暴露分離左右側腎蒂,結扎阻斷30 min后解除阻斷,恢復血流,完成腎臟急性缺血再灌注損傷。隨后沿左側第五肋間切口,逐層切開胸腔,放置胸腔撐開器,顯露心臟、剪開心包膜,在左耳與肺動脈根部之間、肺動脈根部2 mm左右,用6-0帶針的手術絲線,縫扎左冠狀動脈前降支。結扎后肉眼可觀察到結扎處周圍的心肌由紅色變為蒼白色,同時一定范圍的結扎遠端心肌活動度減弱或消失,表明心肌梗死模型建立。假手術組僅分離肌肉、血管等,不做任何缺血再灌注及結扎處理。術后腹腔滴入慶大霉素預防感染,逐層縫合關閉腹腔和胸腔,放回籠中。

1.4.2 分組及給藥方法 將造模后并存活的大鼠按照體質量隨機分為4組：2周模型組、2周藥物組、4周模型組和4周藥物組,每組10只。將存活的假手術組大鼠按照體質量隨機分為2組：2周假手術組和4周假手術組,每組10只。自手術后第一天開始進行藥物干預,藥物組給予芪藶強心灌胃,劑量4 g/ （kg·d）,分別連續給藥2周和4周。假手術組和模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃處理。

1.4.3 標本取材 （1）尿液,取材前一天將大鼠置于代謝籠單籠飼養,收取大鼠24 h尿液,3 000 r/min離心20 min,取上清-80 ℃保存待檢。（2）血清,給藥結束后第2天,按40 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,剖腹暴露腹主動脈并采血。全血樣品于室溫放置2 h或4 ℃過夜后于3 000 r/min離心20 min,取上清-80 ℃保存待檢。（3）腎組織,采血后分離腎組織并剔除周圍脂肪組織,生理鹽水沖洗后分成兩部分,一部分置于4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋保存,一部分立刻投入液氮,轉入-80 ℃保存。

1.4.4 心臟超聲和血流動力學檢測 給藥結束后第2天,按40 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,固定后采用彩色多普勒超聲顯像儀進行心臟超聲檢查,記錄心電圖參數：①左室舒張末期內徑 （LVDd）與收縮末期內徑（LVDs）；②左室射血分數（LVEF）。采用多功能電生理記錄儀進行血流動力學檢測,記錄血流動力學參數：①主動脈收縮壓 （SBP）和舒張壓 （DBP）；②左室收縮末壓（LVSP）和左室舒張末壓（LVDP）。

1.4.5 生化指標檢測 采用ELISA法檢測血清中CysC和Cre。檢測24 h尿液中MAU和NGAL。

1.4.6 RT-PCR檢測腎臟組織NOX2 mRNA表達 取部分液氮凍存腎臟組織,用Trizol法提取總RNA,利用TaKaRa逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。以逆轉錄的cDNA為模板,分別擴增NOX2和內參基因GAPDH。GAPDH正向引物5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′,反向引物5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′；NOX2正向引物 5′-CCCTCCTATGACTTGGAAATGG-3′,反向引物5′-AGCAAA GTAGAAAAGGGCAACC-3′。PCR條件為：95 ℃預變性1 min,94 ℃變性15 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸45 s,共40個循環,72 ℃延伸7 min。用2-△△Ct法計算NOX2/GAPDH比值,反映NOX2相對表達水平。

1.4.7 Western blot檢測腎臟組織NOX2蛋白表達 取部分液氮凍存腎臟組織碾碎,提取總蛋白。使用BCA （聚氰基丙烯酸正丁酯）法測定樣品蛋白濃度。取20 μg蛋白進行SDS-PAGE （十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺）凝膠電泳,然后將蛋白轉移至PVDF （聚偏氟乙烯）膜上,采用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入一抗anti-NOX2 antibody （1 ∶1 000）或anti-GAPDH antibody,4 ℃孵育過夜,洗滌后加入HRP （辣根過氧化物酶）標記的二抗山羊抗兔IgG （免疫球蛋白G,1 ∶10 000）室溫孵育30 min,洗滌后滴加ECL （電化學發光）混合溶液到膜的蛋白面側,暗室中曝光1 min,使用全自動數碼凝膠圖像分析系統拍照觀察,并計算相對于GAPDH （甘油醛-3-磷酸脫氫酶）的平均吸光度值以表示NOX2蛋白相對表達水平。

1.4.8 腎臟組織ROS水平檢測 取-80 ℃保存的部分腎臟組織,脫水包埋后切成厚度4 μm的切片。將活性氧ROS檢測熒光探針DHE使用無菌水按照1 ∶10 000稀釋,將稀釋后的探針溶液滴加到組織上,以完全覆蓋為宜,37 ℃孵育30 min,1×PBS洗去多余探針溶液,用抗熒光淬滅劑封片,使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統計學分析方法 運用統計分析軟件SPSS 19.0進行數據分析,計量數據以（）表示,兩組間比較采用t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠心功能的影響 血流動力學檢測結果顯示,芪藶強心膠囊灌胃2周后,與2周假手術組比較,2周模型組大鼠DBP和LVESP降低（P＜0.05）,LVEDP顯著升高（P＜0.01）；而與2周模型組比較,2周藥物組大鼠DBP和LVESP升高 （P＜0.05）,LVEDP降低（P＜0.05）。4周后,與4周假手術組比較,4周模型組大鼠DBP和LVESP降低（P＜0.05）,LVEDP顯著升高（P＜0.01）；與4周模型組比較,4周藥物組大鼠DBP升高（P＜0.05）,LVEDP降低（P＜0.01）,如表1所示。心臟超聲檢測結果顯示,芪藶強心膠囊灌胃2周后,與2周假手術組比較,2周模型組大鼠LVDd和LVDs顯著升高（P＜0.05）,LVEF顯著降低（P＜0.05）；與2周模型組比較,2周藥物組大鼠LVDd和LVDs則又顯著降低（P＜0.05）,LVEF顯著身高（P＜0.05）；而4周后,4周模型組大鼠心心電圖參數進一步惡化,而4周藥物組則進一步改善,如表2所示。表明,芪藶強心膠囊能改善CRS模型大鼠心功能,并隨治療時間的延長而效果更顯著。

表1 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠血流動力學的影響（， n=10，1 mmHg=0.133 kPa）

表1 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠血流動力學的影響（， n=10，1 mmHg=0.133 kPa）

注：與同時期模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

表2 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠心臟超聲心電圖參數的影響（， n=10）

表2 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠心臟超聲心電圖參數的影響（， n=10）

注：與同時期模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.2 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠腎功能的影響 如表3所示,與2周假手術組比較,2周模型組大鼠血清Cys-C、Cre含有量和尿MAU、NGAL含有量均顯著升高（P＜0.05,P＜0.01）；與2周模型組,2周藥物組血清Cys-C、Cre含有量和尿MAU、NGAL含有量則又顯著降低（P＜0.05）。4周后,4周模型組大鼠血清Cys-C、Cre含有量和尿MAU、NGAL含有量繼續顯著上升,而4周藥物組大鼠中以上腎功能損傷指標則繼續處于低水平。表明,芪藶強心膠囊可以顯著改善CRS模型大鼠的腎功能。

表3 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠腎臟功能的影響（， n=10）

表3 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠腎臟功能的影響（， n=10）

注：與同時期模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

2.3 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠腎臟組織NOX2表達的影響 如表4所示,芪藶強心膠囊灌胃2周或4周后,模型組大鼠腎臟組織中NOX2 mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著高于同時期的假手術組（P＜0.05,P＜0.01）,而藥物組NOX2 mRNA和蛋白的表達則又低于模型組（P＜0.05,P＜0.01）。說明,芪藶強心膠囊治療可以顯著抑制CRS大鼠腎臟組織NOX2表達。

2.4 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠腎臟組織ROS水平的影響 腎臟組織ROS水平檢測結果如圖1所示,2周模型組和4周模型組ROS水平顯著高于對應的假手術組,而2周藥物組和4周藥物組ROS水平則顯著低于同時期的模型組。表明,芪藶強心膠囊可以降低CRS模型大鼠腎臟組織的ROS水平。

3 討論

目前,治療CRS的方法主要集中在糾正血流動力學紊亂和腎臟的替代治療。然而,CRS的發病機制涉及眾多方面,包括血流動力學的改變、神經內分泌系統的過度活化、內皮功能障礙、氧化應激、炎癥反應等［5］。芪藶強心膠囊是一種傳統中藥復方制劑,具有益氣溫陽、活血通絡、利水消腫功效。有研究表明,芪藶強心可以通過抑制RAAS系統（腎素-血管緊張素-醛固酮系統）的激活、保護血管內皮功能、抑制心室重構和代謝重構來改善心、腎功能［6］。本研究通過構建心腎綜合征動物模型,證實芪藶強心膠囊可以通過抑制組織氧化作用改善大鼠腎功能,對進一步完善芪藶強心療效機制的研究具有重要意義。

表4 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠腎臟組織NOX2 mRNA和蛋白表達水平的影響（， n=10）

表4 芪藶強心膠囊對CRS模型大鼠腎臟組織NOX2 mRNA和蛋白表達水平的影響（， n=10）

注：與同時期模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

圖1 各組大鼠腎臟組織ROS水平（200×）

心臟左冠狀動脈前降支結扎制備心肌梗死是目前用于研究心肌損傷的最常用方法,而腎臟急性缺血再灌注可導致急性腎損傷,這2種方法可模擬不同程度的心、腎功能損傷,可用于制備CRS模型［7］。本研究采用左冠狀動脈前降支結扎聯合腎臟急性缺血再灌注損傷的手術方法制備CRS模型,較單一手術的模型制備方法,該方法具有操作簡單、手術過程可控、心腎損傷程度一致性較強等特點。采用心臟超聲和血流動力學檢測的方法觀察模型動物心功能變化,結果顯示,2周、4周后藥物組大鼠血流動力學指標SBP、DBP、LVESP和LVEDP較模型組均有所改善；心臟超聲結果顯示,2周、4周后藥物組大鼠LVDd、LVDs和LVEF較模型組也均有所改善。說明,芪藶強心膠囊可以改善CRS大鼠心功能。秘紅英等［8］研究顯示,經側腦室注射芪藶強心膠囊可改善慢性心衰大鼠心功能,減輕心肌組織形態的改變。楊龍等［9］臨床研究結果也顯示,芪藶強心膠囊可以通過降低冠心病合并心力衰竭患者血清氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、脂聯素（APN）水平,促進患者心功能的提升。

Cre和MAU是臨床檢測腎損傷的金標準,但受患者年齡、性別、肌肉質量等多種因素影響并不能及時可靠的反映急性腎損傷［10］。Cys-C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑,腎小球受損時血液中含有量增高,不受肌肉質量影響；NGAL是腎小管損傷標志物,能在腎小管受損時迅速釋放。兩者均能更好地預測腎衰患者的腎功能惡化［11-12］。本研究聯合檢測血清Cre、Cys-C以及尿NGAL和MAU評估模型大鼠腎功能。結果顯示,2周和4周的模型組大鼠血清Cre、Cys-C以及尿NGAL和MAU含有量顯著高于同時期的假手術組,說明模型組大鼠腎功能嚴重受損。與模型組比較,2周和4周藥物組血清Cre、Cys-C以及尿NGAL和MAU含有量則又顯著降低,說明芪藶強心膠囊可以改善CRS模型大鼠腎功能。王蔚蔚等［13］在臨床研究中也證實,芪藶強心膠囊也能改善慢性腎功能不全伴心力衰竭患者的腎功能。

機體內ROS積累過多或系統抗氧化能力降低,都可以導致組織臟器的病理損傷。有研究表明,在多種腎臟疾病中,氧化應激誘導的腎小管上皮細胞損傷是其病理機制之一［14］。ROS是生物有氧代謝過程中的一種副產物,主要包括超氧陰離子 （O2ˉ）、羥自由基 （·OH）、過氧化氫（H2O2）等自由基團,而機體內NADPH氧化酶（NOX）是產生ROS的主要來源。Basile等［15］研究表明,在經缺血-再灌注的大鼠腎臟中,氧化應激反應可導致腎臟血流動力學變化和纖維化,而NOX抑制劑夾竹桃麻素可以通過減輕氧化應激,從而改善腎血流量、減輕腎血管阻力、減輕腎臟纖維化。本研究結果顯示,在2周和4周模型組大鼠的腎臟組織中NOX2蛋白表達水平及mRNA水平均較同期假手術組顯著上升,而2周和4周藥物組大鼠腎臟組織中NOX2蛋白和mRNA水平則顯著低于同時期模型組。同時,組織ROS檢測結果顯示,2周和4周模型組大鼠的腎臟組織中ROS水平顯著高于同時期假手術組,藥物組則又顯著低于模型組。說明,在CRS模型大鼠腎臟組織中存在較高的氧化應激水平,而芪藶強心膠囊可以通過抑制NOX2表達來抑制CRS模型大鼠腎臟組織中ROS水平。錢玉紅等［16］研究也證實,芪藶強心膠囊清除氧自由基和抗脂質過氧化的功能。

綜上所述,芪藶強心膠囊可抑制NOX2的表達,減低腎組織中ROS水平,改善CRS模型大鼠心、腎功能的損傷。但有關芪藶強心膠囊抑制NOX2表達的機制還需進一步研究。