基于文獻計量學和系統藥理學分析血府逐瘀湯治療冠心病的分子機制

徐文華趙 陽#寧桂蘭馬曉聰趙新望王海娟張曉文鄭景輝

（1.廣西中醫藥大學，廣西南寧 530011；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院心內科，廣西南寧 530000）

冠心病是指發生在冠狀動脈中的動脈粥樣硬化斑塊,是世界范圍內最常見的心血管疾?。?］。根據《中國心血管病報告2017》,2015年中國城市和農村居民冠心病死亡率繼續2012年以來的上升趨勢［2］?，F代醫學治療冠心病雖然效果明顯,但是不良反應明顯。中醫藥治療冠心病效果良好且不良反應較小。目前,中醫藥的化學成分和藥理活性研究方法很多,包括薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜-質譜法（HPLC/MS）、核磁共振法（NMR）和動物實驗、細胞實驗、生化實驗等［3］。方法耗時、成本高、效益低,僅用傳統的實驗方法分析中醫藥的作用機制是比較困難的,因此課題組采用系統藥理學方法基于分子層面對血府逐瘀湯進行研究。通過計量文獻學方法,對當前治療冠心病的熱門中藥或方劑的使用性進行篩選。初步驗證和預測了熱門方劑治療冠心病的作用機制,以期為進一步深入揭示其作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 文獻來源與檢索策略 在中國知網數據庫檢索自建庫以來所收集的中醫藥治療冠心病的相關文獻,具體檢索式見圖1。

1.2 提取文獻數據并繪制中藥相關的高頻關鍵詞共現圖、聚類分析圖 應用書目共現分析系統軟件提取檢索文獻的發表的關鍵詞,選取出現頻次≥10以上的關鍵詞作為高頻關鍵詞,并對高頻關鍵詞進行共現分析。摘取與中藥（復方、單味藥、中成藥）相關的共現關系,導入Cytoscape

3.6.1 軟件中生成共現圖。摘取中藥（復方、單味藥、中成藥）之間相關的共現關系,導入IBM SPSS v21統計分析軟件中生成聚類分析圖。

1.3 高頻方劑的化學成分收集以及靶點預測 利用TCMSP （中藥系統藥理學數據庫分析平臺）數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/）檢索高頻方劑中的藥物對應的化學成分,以建議藥物篩選標準：口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%［4］,類藥性（drug likeness,DL）≥0.18［5］,篩選高頻方劑中高頻方劑中的活性成分以及靶點。

1.4 冠心病相關數據構建 本研究基于CTD （應用毒性與基因比較數據庫）、TTD （治療靶點數據庫）及GeneCards數據庫綜合篩選冠心病相關靶點,TTD數據庫是一個提供關于耐藥性突變的對目標和藥物基因表達和目標組合的數據庫［6］,GeneCards數據庫是一個可搜索的、集成的數據庫,它提供了關于所有注釋和預測的人類基因的全面的信息。提供GiftS算法,構建基因與疾病的相關度排序,根據“Relevance score” 可在特定疾病對應的眾多靶點中進一步篩選相關度更高的靶點從而減少冗余,經三大數據庫挖掘共同篩選冠心病相關基因。利用Venn分析工具,將三大數據庫與血府逐瘀湯潛在靶點進行比對分析得到血府逐瘀湯作用于冠心病的靶點。并利用Cytoscape 3.6.1軟件蛋白互作網絡圖和化合物靶點圖。

1.5 血府逐瘀湯作用靶點的生物信息學分析 將血府逐瘀湯潛在藥效靶點的上傳到David 6.8數據庫 （https：//david.ncifcrf.gov/）中,進行GO （基因本體）分析和KEGG （基因組百科全書）分析。將GO分析生物過程（biological process,BP）、細胞成分 （cellular component,CC）、分子功能（molecular function,MF）結果數據導入GraphPad Prism 7.0軟件進行可視化分析。并利用Omicshare （http：//www.omicshare.com/）網站繪制氣泡圖。

1.6 血府逐瘀湯主要活性成分-血府9010瘀湯對冠心病作用靶點分子對接結果分析系統分子對接（systems dock）Systems Dock Web Site （http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）數據庫,是一個基于網絡藥理學的預測和分析的Web服務器,它應用高精度對接模擬和分子路徑圖來綜合表征配體選擇性,并說明配體如何作用于復雜的分子網絡。系統對接應用AutoDock Vina進行對接模擬,預測蛋白質和配體結合的性能,調整X-Y-Z坐標和網格大小以細化綁定的位置［7］。對接結果的分數=（PKD/PKI）的負對數,Docking Scores的值通常為0至10。登陸Systems Dock Web Site數據庫,將血府逐瘀湯拓撲學參數計算出最主要的5個化合物與血府逐瘀湯治療冠心病靶點拓撲學參數中計算的前5蛋白輸入PDB ID,找活性位點,計算格點,調整X-Y-Z坐標來細化位置。輸入化合物的化學分子結構,成功后開始對接,整理對接結果中的Docking Score并分析。

2 結果

2.1 文獻檢索的結果 根據圖1檢索式,在中國知網中共收集到自建庫以來中醫藥治療冠心病的相關文獻5 451篇。

2.2 文獻的關鍵詞提取結果 通過書目共現分析系統軟件（BICOMB）,從5 451篇文獻中共提取6 443個關鍵詞,選取頻次≥10以上的關鍵詞作為高頻關鍵詞,共得到高頻關鍵詞309個,頻次累計百分比占總頻次的60.026 4%。其中27個關鍵詞與中藥（復方、單味藥、中成藥）相關,見表1。摘取與中藥（復方、單味藥、中成藥）相關的共現關系,將所得結果導入Cytoscape3.6.1軟件,生成共現圖（圖2）。導入IBM SPSS v21統計分析軟件,生成聚類圖（圖3）。經文獻計量學結果計算發現血府逐瘀湯在中醫藥治療冠心病的過程中應用最為廣泛。

2.3 血府逐瘀湯有效成分篩選 通過篩選得到血府逐瘀湯活性成分148種,其中枳殼5種、桃仁23種、當歸2種、紅花22種、赤芍29種、甘草42種、生地黃2種、川芎7種、桔梗7種、柴胡17種、牛膝20種。其中潛在作用靶點138個,作用于冠心病的靶點38個,其中包括細胞色素P450 （CYP3A4）、超氧化物歧化酶（SOD）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮合酶（NOS2）、絲裂原活化蛋白激酶1 （MAPK1）、白細胞介素-6受體亞單位α （IL-6）等。GO分析得到27個生物學過程,其中包括細胞對血管內皮生長因子刺激的反應 （cellular response to vascular endothelial growth factor stimulus）、血管生成 （mammary gland alveolus development）、過氧化氫對缺氧的反應基因表達的正調控（esponse to hydrogen peroxide response to hypoxia positive regulation of gene expression）等；3個細胞組成包括細胞外區域（extracellular region）、細胞小凹（caveola）、細胞外空間（extracellular space）和4個分子功能血紅素結合（heme binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、相同的蛋白結合（identical protein binding）、酶結合（enzyme binding）；KEGG分析得到22條信號（取本杰明矯正P＜0.01）通路包括：HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路 （TNF signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路 （PI3K-Akt signaling pathway）、FoxO信號通路（FoxO signaling pathway）等與心血管疾病高度相關的信號通路 （具體結果見圖4～6、表2）。

表1 中藥（復方、單味藥、中成藥）相關的高頻關鍵詞

圖2 中藥（復方、單味藥、中成藥）相關的共現關系共現圖

圖3 中藥類（復方、單味藥、中成藥）高頻關鍵詞聚類圖

圖4 血府逐瘀湯的蛋白互作網絡圖（節點大小、連線粗細根據拓撲學相關參數繪制）

2.4 分子對接結果 系統分子對接結果血府逐瘀湯對冠心病作用靶點分子對接結果如表3所示。一般認為分子對接結合力值大于4.25表示對接分子與靶點之間有一定的結合活性,大于5.0表明對接分子與靶點之間有較好的結合活性,大于7.0則說明具有強烈的結合活性［8］。分子對接結果顯血府逐瘀湯多個靶點的Docking Score值大于8.0證明有強烈的結合活性,見圖7,且多個靶點大于5.0。由此表明血府逐瘀湯主要化學成分與血府逐瘀湯對冠心病作用靶點有較好的結合活性。

圖5 血府逐瘀湯的化合物靶點圖

圖6 血府逐瘀湯作用靶點的GO分析

表2 血府逐淤湯作用于冠心病的KEGG分析結果

3 討論

冠心病屬于中醫“胸痹” “心痛” “心悸” “喘證”“水腫” 等病范疇,中藥相對于西藥較為安全可靠［9］。中醫理論從整體和宏觀的角度出發,強調辨證論治、從整體出發協同配伍。但是由于中藥配伍的復雜性且具有多因、多效、多靶點的特點,其作用于疾病的具體分子機制難以被闡明。本研究通過文獻檢索、共現分析和聚類分析等文獻計量學分析,探討中醫藥干預治療冠心病的常用藥。利用系統藥理學的方法根據機體對外援化學物質的吸收、分布、代謝、排泄、以及化合物對機體的毒性篩選出中藥有效成分。血府逐瘀湯是經文獻計量學計算臨床應用研究最為廣泛的方劑?，F代藥理學研究表明［10-11］,血府逐瘀湯可以通過調節mRNA的表達影響細胞的壽命,控制血管的生成,降低神經損傷。并且可以改善腦血管舒縮功能、降低細胞損傷,從而改善血液供應。

圖7 血府逐瘀湯主要化學成分與血府逐瘀湯對冠心病作用靶點分子對接結果示例（僅列出Docking值大于8.0的）

表3 血府逐瘀湯主要化學成分與血府逐瘀湯對冠心病作用靶點分子對接結果

對血府逐瘀湯與其他309個高頻關鍵詞的共現分析,如圖2所示,發現共有29個高頻關鍵詞與血府逐瘀湯存在共現關系,其中涉及病機的關鍵詞有血液流變學、血瘀、氣虛血瘀、血脂,涉及治法的關鍵詞是活血化瘀,研究表明,血府逐瘀湯治療冠心病的機制主要有以下幾個方面［12］,（1）抗血小板聚集：前期研究顯示,血府逐瘀湯可干預血清PAF （血小板活化因子）含有量升高,以抑制血小板聚集,改善微循環及血管內皮功能,助緩動脈粥樣硬化形成。（2）改善循環抗心肌缺血：研究報道,血府逐瘀湯通過下調CRP （反應蛋白）、BNP （腦鈉肽）水平可緩解炎癥的刺激,使血管舒張、血流量提升,減輕心肌容量負荷,避免心肌細胞受損。（3）調血脂：血府逐瘀湯通過降低后主動脈脂質斑塊MPO （髓過氧化物酶）指標,使血脂四項含有量減少,從而使血管壁結構改變,延緩動脈粥樣硬化（AS）進程。據《醫林改錯》 書中描述血府逐瘀湯由桃紅四物湯、四逆散加桔梗、牛膝組成,其中桃紅四物湯有活血化瘀而養血的功效；四逆散有疏肝理氣,氣行則血行得作用；另配伍桔梗引藥上行于胸中,牛膝引血下行利血脈。諸藥調和,共奏祛瘀、活血、行氣、通絡、止痛。另外對27個與中藥（復方、單味藥、中成藥）相關的高頻關鍵詞進行聚類分析,如圖3所示,27個高頻關鍵詞被從上到下依次分為10級樹狀圖血府逐瘀湯處于樹狀圖的最高級層,進一步說明血府逐瘀湯在治療冠心病藥物中的重要地位。

本研究發現經過系統藥理學方法篩選,血府逐瘀湯中槲皮素在一定濃度范圍內可明顯抑制血管緊張素誘導的心肌成纖維細胞增值和膠原蛋白合成增加,同時可升高SOD含有量、降低MDA （丙二醛）活力,從而延緩心肌纖維化的發展［13］。異鼠李素具有抗炎、抗氧化、抗脂肪形成、抗增殖和抗腫瘤活性的作用,Gao等［14］新生大鼠心肌細胞中進行的體外研究證實,異鼠李素可以減弱血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大,而血管緊張素Ⅱ與PI3K-AKT信號通路有關,異鼠李素具有通過阻斷PI3K信號傳導途徑靶向心臟肥大的保護潛力。Zhou等［15］通過對山柰酚處理對大鼠心肌缺血模型中發現,山柰酚預處理顯著提高了LVDP（左室發展壓）的恢復率和土dp/dt max,并提高了SOD和phospho-GSK-3β 水平以及GSH/GSSG （谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽）比值；減少了心肌梗塞面積和TUNEL （原位末端標記法）陽性細胞率,并降低了裂解的caspase-3 （半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）、細胞質細胞色素C、CK （肌酸激酶）、LDH （乳酸脫氫酶）、MDA和TNF-α 的水平,通過抗氧化活性和抑制GSK-3β 活性提供心臟保護作用。Liao等［16］在小檗堿干預大鼠心肌梗死后心力衰竭模型中發現小檗堿能通過上調Bcl-2 （B細胞淋巴瘤）和下調caspase-3表達,從而抑制心臟重塑和保護心臟功能。除此之外,血府逐瘀湯中還有芍藥苷、豆甾醇等通過調節炎癥因子、細胞因子和氧化損傷來干預血管內皮細胞損傷,從而起到血管內皮保護作用的化合物。

在對血府逐瘀湯治療冠心病的作用靶點其生物學過程分析中,提示血府逐瘀湯在治療冠心病的過程中與一氧化氮合成、激活MAPK活動、血管生成等活動密切相關。TNF-α、IL-1B、MAPK1等均富集在以上通路中。TNF-α 參與免疫反應的調節,對冠狀動脈上皮平滑肌細胞增殖具有誘導的作用,并且會誘導IL-β 等炎性因子的產生,從而促進動脈粥樣硬化的發生。白細胞介素-1β 作為血清炎性指標的一類,對血管功能具有調節的作用,在冠心病中表達水平較高。p38MAPK參與了NF-κB的激活,可誘導缺氧心肌細胞凋亡,抑制p38MAPK可改善心肌損傷動物心功能不全、減少心肌細胞凋亡的發生［17］。過程在KEGG富集分析中得到的HIF-1 （缺氧誘導因子）信號通路,在現代藥理學研究中表明［18］HIF-1α 在參與對低氧反應基因的調控,可以促進VEGF、促紅細胞生成素（EPO）、HO-1等因子的表達。在冠心病發生、發展過程中HIF-1/HO-1被激活,通過抗氧化作用保護血管內皮細胞及心肌細胞并通過調節細胞生長減少內皮細胞凋亡,保護內皮系統的穩定性,同時促進血管平滑肌凋亡,減輕血管損傷后的不良重構。PI3K/AKT信號通路作為治療心血管疾病的明星通路,PI3K/AKT信號通路的活化可以介導多種生物學效應,它通過調節心肌細胞凋亡、血管再生進而影響其在心血管系統的表達［19］。FoxO轉錄因子［20］是一類在許多生理功能中重要的高度保守蛋白。然而,即使FoxO是胰島素的下游靶標,FoxO因子也控制上游信號元件控制胰島素敏感性和葡萄糖代謝。FoxO活性的變化通過抑制蛋白磷酸酶對心肌細胞中的胰島素信號傳導具有劑量響應性抑制作用。此外KEGG信號通路分析結果提示除以上被證實的通路以外Focal adhesion信號通路,可以調節肌動蛋白,肌動蛋白的調節與第二生心區祖細胞構成非經典頂端-基底極性上皮有一定相關性。

本研究應用系統藥理學方法對血府逐瘀湯藥治療冠心病的化學成分、作用靶點和作用機制進行初步探索性研究,以期為進一步的實驗驗證奠定基礎。由于中藥復方成分復雜、靶點眾多等多種原因,中藥方劑中可能存在的小分子多肽、或是中藥復方通過腸道菌群調節等方式間接對疾病進行調控。且由于方法學限制未從中藥所含化學成分的含有量進行分析,尚需從LC-MS/MS分析其真實入血成分。并且由于數據庫信息不全面、目前認識的不全面性、化合物篩選的主觀性,且只關注于藥物的組成成分,忽略了其成分的含有量、化合物之間的相互作用以及藥物體內代謝過程等的影響,故研究預測的結果具有一定的片面性和局限性,需要進一步加入實驗驗證。