白藜蘆醇改善帕金森病中小膠質細胞炎癥誘發細胞凋亡的機制研究

張二飛，殷 紫，齊 越

（1.江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇淮安 223003；2.江蘇護理職業學院，江蘇淮安 223005；3.江蘇省徐州醫藥高等職業學校，江蘇徐州 221116）

帕金森?。≒arkinson’s disease,PD）是一種常見的神經退行性疾病,在1817年被首次發現并命名［1］。其主要臨床癥狀表現為運動遲緩、肌肉僵直等現象［2］。PD的病因尚不明確,致病機制復雜多樣,目前研究認為包括環境因素、細胞中亞細胞器結構的破壞、氧化應激、神經炎癥等［3］。而神經炎癥是眾多退行性疾病和衰老的主要病理特征之一,其中介導中樞神經系統炎癥反應的關鍵免疫細胞為小膠質細胞,活化的小膠質細胞釋放大量促炎因子,損傷血腦屏障和神經突觸,引發中樞神經系統穩態的失衡［4］。目前,關于針對神經炎癥臨床治療的藥物尚不能有效地控制PD的發展與不良反應的產生,因此,深入對神經炎癥的機制研究,開發具有多靶點、安全有效的治療藥物尤為重要。大量基礎研究與現代藥理學分析顯示：白藜蘆醇（resveratrol,RSV）具有抗炎、抗氧化損傷等多種作用［5-7］。本研究通過研究白藜蘆醇對LPS和ATP誘導的小膠質細胞凋亡作用的影響,深入探討其作用機制,以期為神經炎癥的體外細胞水平研究增加新的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 蛋白凝膠電泳-電轉系統（美國Biorad公司）；BCA蛋白定量雙波長酶標儀、冷凍離心機（美國ThermoFisher公司）；ECL曝光顯影系統 （美國 GE Healthcare公司）；Hoechst熒光顯微鏡 （日本NIKON公司）；白藜蘆醇（美國Selleck公司,批號S1396）；胰酶（碧云天生物技術公司,批號C0202-100 ml）；胎牛血清（FBS,美國ThermoFisher-GIBCO公司,批號10099-141）；F12-DMED （美國 ThermoFisher-GIBCO公司,批號C11330500BT）；脂多糖 （LPS,美國Sigma-Aldrich公司,批號L2880-25 mg）；三磷酸腺苷（ATP,美國Selleck公司,批號S1985）；RIPA裂解液（江蘇凱基生物公司,批號KGP703-100）；Hoechst熒光染料（美國ThermoFisher-Invitrogen公司,批號H1399）；磷酸鹽緩沖液（PBS,江蘇凱基生物公司,批號KGB003）；甘油（江蘇凱基生物公司,批號KGT519100）；一抗兔抗TLR4 （1 ∶ 1 000,英國Abcam公司,批號ab13556）；兔抗p-NF-κB （1 ∶1 000,美國CST公司,批號3033）；兔抗NF-κB （1 ∶1 000,美國CST公司,批號8242）；兔抗IL-1β （1 ∶1 000,美國CST公司,批號83186）；鼠抗BCL-2 （1 ∶1 000,美國CST公司,批號15071）；兔抗BAX （1 ∶1 000,美國CST公司,批號5023）；鼠抗ACTIN （1 ∶2 000,Santa公司,批號SC-47778）；二抗Goat anti-Rabbit IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP與Goat anti-Mouse IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP （美國Invitrogen公司,批號31460,批號62-6520）。

1.2 小膠質細胞來源 本研究所用小膠質細胞為原代小膠質細胞,取新生1～3 d C57/B6乳鼠進行實驗,實驗所用小鼠購自于南京青龍山實驗動物基地,生產許可證號SCXK（蘇）2017-0001。

1.3 離體細胞水平研究與實驗分組 本研究中所使用細胞為小鼠原代小膠質細胞。1～3 d新生C57乳鼠通過剝離腦膜,去除腦膜上血絲后,使用0.25%胰酶消化腦組織,過40 μm細胞篩網,所得濾液離心,1 500 r/min離心10 min,將離心所得細胞沉淀重懸后鋪種于T25瓶中,加6 mL含有10% fatal bovine serum （FBS）Gibco-F12/DMED培養基,次日更換新鮮培養基,后隔3 d換液,細胞培養至10～12 d可見小膠質細胞長出,用力平搖T25小瓶,吸取瓶內培養基后離心,1 500 r/min離心10 min,所得細胞沉淀即為小膠質細胞,種于24孔板后,次日貼壁,可用于實驗研究。實驗分為空白組、LPS+ATP組、白藜蘆醇組和LPS+ATP+白藜蘆醇組。LPS刺激劑量為100 ng/mL （6 h）,ATP為5 mmol/L （30 min）；白藜蘆醇預提前給藥3 h,給藥劑量一次為25 μmol/L。

1.4 Western blot檢測相關蛋白表達 RIPA裂解液裂解（含蛋白酶與磷酸酶抑制劑）細胞蛋白后,刮取細胞蛋白,離心16 000 r/min,15 min,棄EP管底部沉淀,吸取上清細胞蛋白進行BCA蛋白定量后,加入5×loading buffer,95 ℃煮沸蛋白使之變性用于后續電泳。細胞蛋白通過電泳、電轉將蛋白分子轉移至PVDF （聚偏二氟乙烯）膜后,使用5% TBST脫脂牛奶封閉條帶1 h后,孵育特異性一抗4 ℃過夜（檢測指標為：兔抗TLR4；兔抗p-NF-κB；兔抗NF-κB；兔抗 IL-1β；鼠抗 BCL-2；兔抗 BAX；鼠抗ACTIN）,次日孵育二抗1 h ［Goat anti-Rabbit IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP與Goat anti-Mouse IgG （H+L）Secondary Antibody,HRP］,TBST洗膜10 min×3次,ECL曝光顯影。

1.5 細胞上清的提取 收集細胞上清后,離心1 000 g,5 min,去除死細胞,小心吸取600 μL上清至另一干凈EP管中,加入等體積預冷的甲醇和1/4體積氯仿,迅速渦旋震蕩后離心,吸棄上清,加入500 μL預冷甲醇后,渦旋震動離心,13 000 r/min離心5 min,小心吸棄上清,將裝有沉淀物的EP管置于37 ℃的烘箱中5 min,加入30 μL的2.5×loading buffer溶解,95 ℃煮沸5 min后上樣進行Western blot分析IL-β 炎癥因子。

1.6 Hoechst細胞凋亡檢測 細胞發生凋亡時,染色質有固縮現象,經Hoechst染色后,在熒光顯微鏡下觀察,正常細胞細胞核呈藍色,而發生凋亡細胞的細胞核會呈現致密濃染,藍色較淡。每組小膠質細胞種于24孔爬片中進行檢測分析,細胞處理后,吸棄培養基,加入磷酸鹽緩沖液（PBS）潤洗3次,每孔加入500 μL Hoechst染料稀釋液（1 ∶3 000稀釋）。室溫孵育15 min,吸棄染料,PBS潤洗3次后,將爬片從24孔板取出,倒扣至載玻片上,PBS加甘油（1 ∶1）封片保存,用于后續顯微鏡拍攝。

1.7 數據統計分析 數據分析使用Graphpad prism7軟件,圖例展示均用 （）表示,采用one-way ANOVA和Student’ s t-test進行組間差異分析。 P＜0.05表示有統計學差異。

2 實驗結果

2.1 白藜蘆醇抑制由LPS和ATP誘發的TLR4/NF-κB/IL-1β 信號通路的激活 原代小膠質細胞種于24孔板后,次日貼壁后可用于實驗研究,白藜蘆醇提前預孵育3 h,后給予炎癥的第一信號LPS刺激6 h,炎癥第二信號ATP刺激30 min。通過Western blot檢測發現,LPS+ATP組TLR4/NF-κB/IL-1β 信號通路被明顯激活,其中LPS+ATP組與空白組相比,TLR4受體上調最為明顯,磷酸化的NF-κB蛋白上調,細胞分泌的成熟體IL-1β 也增多 （P＜0.01）。LPS+ATP+白藜蘆醇組與LPS+ATP組相比,則減弱了TLR4/NF-κB/IL-1β 信號通路的激活,TLR4受體下調明顯,磷酸化NF-κB蛋白下調最明顯,細胞分泌的成熟體IL-1β也減少（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.2 白藜蘆醇對炎癥刺激下小膠質細胞的凋亡蛋白的影響 通過檢測原代小膠質細胞中凋亡相關蛋白發現,與空白組比較,LPS+ATP誘導了小膠質細胞的凋亡反應,表現為BCL-2的顯著降低（P＜0.01）,BAX水平的顯著升高（P＜0.01）。而提前預給白藜蘆醇,LPS+ATP+白藜蘆醇組與LPS+ATP組比較,改善了LPS+ATP引發的細胞凋亡現象,BCL-2升高（P＜0.05）,BAX水平降低（P＜0.05）。見圖2、表2。

表1 白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表達的影響（， n=4）

表1 白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表達的影響（， n=4）

注：與空白組比較,##P＜0.01；與LPS+ATP組比較,*P＜0.05。

圖1 白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞TLR4/NF-κB/IL-1β 表達的影響（， n=4）

圖2 白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞BAX、BCL-2表達的影響（， n=4）

2.3 白藜蘆醇對炎癥刺激下小膠質細胞凋亡的影響 細胞發生凋亡時,染色質有固縮現象,經Hoechst染色后,在熒光顯微鏡下觀察,正常細胞細胞核呈藍色,而發生凋亡細胞的細胞核會呈現致密濃染,藍色較淡。在本研究中,小膠質細胞在LPS+ATP刺激下染色質有固縮現象且細胞核藍色較淺,與空白組比較,細胞發生凋亡損傷（P＜0.01）,而提前預孵育白藜蘆醇后,LPS+ATP+白藜蘆醇組與LPS+ATP組比較明顯改善了凋亡現象（P＜0.01）。提示白藜蘆醇可改善由LPS+ATP引起的細胞凋亡損傷。見圖3、表3。

表2 白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞BCL-2、BAX表達分析的影響（， n=4）

表2 白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞BCL-2、BAX表達分析的影響（， n=4）

注：與空白組比較,##P＜0.01；與LPS+ATP組比較,*P＜0.05。

表3 Hoechst染色分析白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞凋亡的影響（， n=4）

表3 Hoechst染色分析白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞凋亡的影響（， n=4）

注：與空白組比較,##P＜0.01；與LPS+ATP組比較,**P＜0.01。

圖3 Hoechst （×100）染色分析白藜蘆醇對LPS+ATP模型原代小膠質細胞凋亡的影響（， n=4）

3 討論

帕金森病是由多種環境因素、生物因素介導的慢性神經退行性疾病,在65歲以上老年人群中患病率達2%～3%,其主要特征為黑質致密部多巴胺能神經元的丟失與路易小體的沉積［8］。隨著帕金森病進程的不斷加深,臨床癥狀常表現為運動遲緩加劇,腦內基底核、海馬等多個腦區神經受損,并伴有嚴重的抑郁癥狀與非運動癥狀［9］。

目前關于帕金森病的治療主要包括藥物治療、手術治療、心理疏導等方面。其中藥物治療是帕金森病主要的治療方式。臨床上主要是通過藥物以達到多巴胺替代來緩解癥狀的目的。然而,長期服用左旋多巴和多巴胺受體激動劑會出現異動癥等不良反應［10］。由于帕金森病致病機制的多樣性與臨床病理表現的復雜性,單一的靶點藥物已不能有效地緩解其病癥,因而亟待研發安全性高、多靶點的活性藥物來治療帕金森病。

由于目前藥物治療存在“劑末效應” 等多種不良反應,開發多靶點安全性高的藥物用于臨床治療。與現代藥理學相比,傳統醫藥具有多靶點以及整體調節等作用,白藜蘆醇具有抗炎抗氧化對代謝性疾病和神經退行性疾病都有相應的治療作用?；A研究中報道：在機體受損的細胞中,白藜蘆醇可通過激活PI3K/AKT （磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B）信號通路,下調凋亡相關蛋白BAX的表達［11］。在本研究中,課題組使用LPS+ATP建立小膠質細胞炎癥模型,探討白藜蘆醇改善炎癥效應的機制。

近年來,隨著基礎研究的不斷深入,人們對小膠質細胞在介導中樞神經炎癥中的作用了解也不斷加深［12-13］。小膠質細胞是腦內的重要免疫調節細胞,對維持中樞神經系統穩態和神經元的發育成熟等起著關鍵作用。靜息狀態下,小膠質細胞呈現細長的突觸,而一旦接受危險信號刺激后,由靜息態轉變成活化的小膠質細胞,激活的小膠質細胞會引發大量促炎因子的產生誘導自身的凋亡反應,破壞腦穩態的平衡［14-15］。研究表明,小膠質細胞表面的多種模式識別受體是介導炎癥反應的主要執行者,其TLRs （Toll樣受體）家族在調節炎癥反應中起到關鍵作用,通常TLR4與危險相關分子模式或病原相關分子模式結合后,激活下游NF-κB通路,促進pro-caspase-1 （caspase-1前體蛋白）與Pro-IL-1β （白細胞介素前體-1β）的轉錄和炎癥小體的組裝等,后CASPASE1 （半胱天冬酶1）切割誘導成熟IL-1β的產生參與神經損傷作用［16-18］。本實驗表明白藜蘆醇抑制了小膠質細胞中TLR4受體的表達,從而減少了NF-κB的激活,下游炎癥相關蛋白轉錄減少,從而抑制了炎癥因子IL-1β 的生成。

Bcl-2家族蛋白是在細胞凋亡過程中起關鍵性作用的一類蛋白質。Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類：一類是具有抑制凋亡作用,Bcl-2是Bcl-2家族中典型的抗凋亡蛋白,其表達量上調可抑制細胞的凋亡；一類具有促進凋亡作用,Bax則是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白,其表達量上調可促進細胞的凋亡。Bax受細胞凋亡信號的影響,可在線粒體膜上產生蛋白孔道,釋放線粒體內的細胞色素C,激活線粒體通路下游caspase家族蛋白酶的級聯反應,從而調控細胞的凋亡［19-21］。研究表明,基于細胞炎癥反應的治療可改善細胞的凋亡損傷水平。本研究中,在小膠質細胞中提前預孵育白藜蘆醇改善了LPS+ATP引發的細胞凋亡現象,逆轉了BCL-2的降低與BAX水平的升高的現象。同時Hoechst染色發現,提前預孵育白藜蘆醇后改善小膠質細胞的細胞核致密濃染,藍色較淡的現相,提示白藜蘆醇改善了小膠質細胞凋亡現象。

綜上所述,白藜蘆醇可能通過抑制TRL4/NF-κB/IL-1β信號通路改善了帕金森病中小膠質細胞炎癥誘發的細胞凋亡現象,同時這一研究成果可結合相應的臨床分析數據,以期為后續靶向小膠質細胞藥物的開發提供理論基礎。