不同成熟期北五味子質量初步評價

李 鉑，唐志書*，許洪波，黃文靜，王 楠，孫曉春，解江冰，劉玉蘭，陸 博

（1.陜西中醫藥大學陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西咸陽 712083；2.陜西云嶺生態科技有限公司，陜西西安 710000；3.柞水縣科技開發中心，陜西柞水 711400）

五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.為木蘭科五味子屬多年生木質藤本,其干燥果實又稱北五味子［1］,為傳統大宗藥材之一,具有澀精止瀉、生津斂汗等功效。北五味子主產東北三省、內蒙古、河北等地［2］,果實富含五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素等木脂素類［3-4］、有機酸、揮發油、多糖等多種化合物［5-6］。秦嶺地區氣候環境適宜、植被類型豐富,分布有華中五味子S.sphenanthera、紅花五味子S.rubriflora、鐵箍散S.propinquavar. sinensis等多種五味子屬植物［7］。北五味子作為傳統中藥和保健食品的原料,隨著市場需求不斷增加,人工種植的北五味子面積逐漸增大,研究采收期對五味子藥材產量和品質的影響具有重要的指導意義。本研究對處于不同成熟期的北五味子進行分批采收,測定果實中總酚酸、總黃酮、總多糖、木脂素類等成分含有量,綜合多項指標,確定移栽于秦嶺地區北五味子的最佳采收時期,以期為五味子藥材規范化種植提供一定的技術指導。

1 材料

美國Waters ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；UV-2600紫外可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；101型電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器公司）。沒食子酸（批號731C031）、福林酚購自北京索萊寶科技有限公司；蘆?。ㄅ?70221）、葡萄糖（批號160509）、五味子醇甲（批號160513）、五味子乙素（批號160521）購自陜西樂博生化有限公司；乙腈（色譜純,美國Honeywell公司）；磷酸（色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為超純水,其余試藥均為國產分析純。

北五味子種植于陜西省商洛市柞水縣北河村陜西云嶺生態科技有限公司五味子科技示范基地內（33°49′52.8″ N,109°12′42.7″ E,海拔1 434 m）,經陜西中醫藥大學王繼濤教授鑒定為木蘭科五味子屬五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.。

2 方法與結果

2.1 樣品采集與前處理 分別于2017年8月15日、8月30日、9月15日采收3批五味子樣品,每批隨機設3個重復,樣品收集后洗凈,50 ℃烘干。取3批已干燥的樣品,粉碎并過3號篩,每個樣品稱0.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入25 mL 70%乙醇,超聲提取30 min,取出放冷,補足減失質量,過濾即得。

2.2 五味子總酚酸含有量測定 采用福林酚法測定五味子中總酚酸含有量［8］。精密量取0.425 mg/mL沒食子酸對照品溶液0、15、30、45、60、75、90 μL,蒸餾水補體積至100 μL,加入福林酚試劑1.5 mL,搖勻；加入7.5%Na2CO3溶液1.5 mL,30 ℃避光反應1.5 h,測定765 nm處吸光度,以沒食子酸含有量為橫坐標（X）,以吸光值為縱坐標（Y）,得回歸方程為Y=0.021 3X+0.057 2 （r=0.997 5）。分別吸取“2.1” 項下待測樣品100 μL,按上述測定方法,記錄765 nm處吸光值,計算總酚酸含有量。結果表明,五味子果實中總酚酸含有量隨采收時間的變化呈現先升后降的趨勢,采收于8月30日的果實中總酚酸含有量最高為15.749 mg/g,見表1。

2.3 五味子總黃酮含有量測定 總黃酮含有量測定采用NaNO2-Al （NO3）3比色法［9］。精密量取1 mg/mL蘆丁對照品溶液0、20、40、60、80、100、120 μL,70% 乙醇補體積至200 μL,依次加入30% 乙醇1.8 mL、5% NaNO20.5 mL,搖勻,靜置6 min；加入10% Al （NO3）30.5 mL,搖勻,靜置6 min；最終加入1 mol/L NaOH 2 mL,搖勻,靜置15 min,測定510 nm處吸光值。以蘆丁含有量為橫坐標（X）,以吸光值為縱坐標（Y）,得回歸方程為Y=0.002 3X+0.009 3 （r=0.996 1）。分別吸取“2.1” 項下待測樣品200 μL,按相同方法測定,記錄510 nm處吸光值,計算總黃酮含有量。結果表明,五味子果實中總黃酮含有量隨采收時間的延長亦表現為先升后降的趨勢,采收于8月30日的果實中總黃酮含有量最高為8.543 mg/g,見表1。

2.4 五味子多糖提取與含有量測定

2.4.1 五味子粗多糖制備 稱取五味子樣品0.250 g,置于具塞錐形瓶中,加入蒸餾水10 mL,超聲20 min,濾過,重復上述提取步驟。取2次水提液,合并,加入無水乙醇,使其終濃度達到80%。4 ℃靜置24 h,10 000 r/min條件下離心5 min,棄去上清,50 ℃烘干至恒定質量,得五味子粗多糖粉末。向粉末中加入25 mL蒸餾水,溶解,待用。

2.4.2 五味子多糖含有量測定 五味子多糖含有量采用苯酚-硫酸法進行測定［10］。精密量取0.1 mg/mL葡萄糖標準品溶液0、50、100、150、200、250、300 μL,蒸餾水補足體積,依次加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL,搖勻,靜置10 min,40 ℃水浴15 min；取出后迅速冰浴,10 min后測定490 nm處吸光值。以葡萄糖標準品濃度為橫坐標（X）,以490 nm處吸光值為縱坐標（Y）,得回歸方程為Y=0.013 8X+0.077 9 （r=0.996 0）。分別吸取“2.4.1” 項下待測樣品300 μL,按上述方法測定490 nm處吸光值,計算多糖含有量。結果表明,五味子果實中多糖含有量隨著五味子果實成熟度的增加逐漸降低,9月15日采收的果實相比8月30日采收的樣品中多糖含有量下降60.92%,見表1。

表1 不同采收期五味子果實中3種指標含有量比較（，mg/g）

表1 不同采收期五味子果實中3種指標含有量比較（，mg/g）

2.5 2種木脂素含有量測定

2.5.1 樣品處理及制備 精密稱定不同采收時間五味子粉末約0.3 g,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇25 mL,稱定質量；超聲提取20 min,取出放冷,再次稱定質量,以甲醇補足失質量；搖勻濾過,取續濾液過0.22 μm微孔濾膜,用于UPLC分析。

2.5.2 對照品溶液制備 分別精密稱定五味子醇甲和五味子乙素對照品各5.0 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制備成0.5 mg/mL的對照品貯備液。

2.5.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）；流動相0.1%磷酸（A）-乙腈（B）,梯度洗脫（0～10 min,90% A,10% B；10～13 min,100% B；13～15 min,90% A,10% B）；體積流量0.2 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm；進樣量2 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC色譜圖

分別精密吸取稀釋至適宜濃度的對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 μL,注入超高效液相色譜儀,在“2.5.3” 項條件下進樣,每個體積進樣3次,記錄各對照品的峰面積,以峰面積為縱坐標（Y）,以對照品質量為橫坐標（X）,進行回歸,結果見表2。表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.5.4 精密度試驗 取同一批次樣品粉末（9月15日采收）,按“2.5.1” 項下方法制備供試品溶液,在“2.5.3”項條件下連續進樣6次,每次2 μL,記錄峰面積,測得五味子醇甲和五味子乙素峰面積的RSD分別為1.16%、1.28%,表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（9月15日采收）,在 “2.5.3” 項條件下,分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進樣2 μL,記錄峰面積,測得五味子醇甲和五味子乙素峰面積的RSD分別為0.87%、1.55%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.6 重復性試驗 分別精密稱取同一批次樣品粉末6份（9月15日采收）,按“2.5.1” 項下方法制備供試品溶液,在“2.5.3” 項條件下分別進樣2 μL,記錄峰面積,五味子醇甲和五味子乙素含有量的RSD分別為2.08%、1.99%,表明該方法重復性較好。

2.5.7 加樣回收率試驗 精密稱取6份含有量已知的9月15日樣品粉末約0.15 g,根據樣品中五味子醇甲、五味子乙素含有量的80%、100%、120%,分別精密加入對照品溶液,按 “2.5.1” 項下方法制備供試品溶液,在“2.5.3” 項條件下進樣,計算加樣回收率,五味子醇甲和五味子乙素平均加樣回收率分別為102.86%、100.07%,RSD分別為2.28%、2.03%。

2.5.8 樣品含有量測定 精密吸取“2.5.1” 項下樣品溶液各2 μL,注入超高效液相色譜儀,在“2.5.3” 項條件下測定2種木脂素的含有量。結果表明,五味子醇甲和五味子乙素含有量隨采收時間的變化呈現先升后降的趨勢,8月30日前后含有量最高,分別達到5.540、3.020 mg/g,見表3。

表3 不同采收期樣品中2種木脂素含有量比較（，mg/g）

表3 不同采收期樣品中2種木脂素含有量比較（，mg/g）

3 討論

本研究通過觀測北五味子移栽于秦嶺地區之后,不同成熟期果實中總酚酸、總黃酮、多糖及木脂素含有量的動態變化規律,發現采收時間對五味子藥材品質相關的多個指標影響顯著?？傸S酮、總酚酸以8月30日前后采收的樣品中含有量最高,多糖含有量隨著采收期的延遲逐漸降低。

研究表明,五味子莖藤、葉和果實中均含較多酚酸和黃酮類成分［11-12］,這兩類成分在不同部位的積累規律為葉＞莖藤＞果實［13］。同時,五味子果實含有豐富的總多糖,具有較強的抗氧化能力［14］。郭志欣等［15］通過對通化市不同采收期栽培五味子多糖含有量進行比較,發現8月下旬栽培北五味子中多糖含有量最高,隨著采收期的延后含有量逐漸下降。潘丕克等［16］發現遼寧地區北五味子種子與果肉中,五味子醇甲和五味子乙素的含有量在采收期呈現先升后降的趨勢,在9月上旬達到最高值。本研究中,8月30日采收的五味子果實中五味子醇甲和五味子乙素含有量最高,不同采收時間五味子醇甲的含有量均高于2015年版《中國藥典》 規定的最低含有量（0.40%）［1］,表明不同引種栽培地區的氣候條件和環境因子可能會影響五味子的最適采收期。

綜合多種指標,并結合當地氣候條件,初步確定移栽于秦嶺地區的北五味子最佳采收時間在8月30日前后,此時五味子藥材的品質為最佳。后續將對不同引種地區、不同生長期北五味子生理生化特性、木脂素生物合成途徑關鍵基因表達水平等開展更深入的研究,構建移栽于秦嶺地區北五味子的動態生長模型和有效成分動態積累模型,以期全面評價北五味子的品質形成規律,更好地為五味子規范化種植和產業發展提供技術支持。